В.П. Стусь, I.С. Шпонька, К.С. Бараннік, О.В. Пославська

Порушення місцевого ниркового кровотоку при моделюванні односторонніх патологічних процесів у нирках

Вступ. Деякі патологічні стани (гостре порушення відтоку сечі або ішемічне ураження) спричинюють стійке порушення ниркового кровообігу, яке призводить до значного порушення функції нирки, внаслідок місцевої атрофії паренхіми або склерозу, змін ангіоархітектоніки, виникнення хронічного запалення. Згідно з останнім дослідженням [1,2], функціональні зміни відбуваються також і в протилежній «здоровій» нирці, що стає особливо актуальним після однобічної нефректомії [3]. Морфологія компенсаторно-пристосовних змін та динаміка їх перебігу в єдиній нирці, що залишилась, на сьогодні недостатньо з’ясовані [4, 5, 6]. Тому дослідження імуноморфологічних аспектів патологічних змін паренхіми нирок щурів з експериментально змодельованими найбільш розповсюдженими патологічними станами (ішемія, порушення уродинаміки) має велике практичне значення.

Мета дослідження: Дослідити патоморфологічні особливості нирок щурів із експериментальним порушенням кровообігу, уродинаміки й кровообігу і уродинаміки разом та стан контралатеральних «здорових» нирок для визначення їх можливих патологічних змін, таких як запалення, ураження судинного русла, за допомогою експресії імуногістохімічних маркерів CD3 та aSMA.

Матеріали та методи дослідження. В експерименті на 24 білих половозрілих щурах лінії Вістар створювали постійну ішемію лівої нирки фіксованим перегинанням її артерії для 15 тварин (група А), робили гостре порушення уродинаміки лівої нирки фіксованим перетинанням її сечоводу на рівні в/з для 4 тварин (група В) і моделювали обидва патологічні стани для 5 тварин (група С). Стан паренхіми десяти відносно здорових щурів брали за контроль (контрольна група) для порівняння (табл. 1).

Дослідження виконано в рамках науково-дослідної роботи «Порушення кровообігу та мікроциркуляції паренхіми нирки, що залишилася після нефректомії, та способи їх корекції». Експериментальні дослідження на щурах проводили з дотримуванням рекомендацій, передбачених Європейською конвенцією з нагляду за проведенням лабораторних та інших дослідів з участю лабораторних тварин різних видів, Конвенцією з біоетики Ради Європи, Гельсінською декларацією Всесвітньої медичної асоціації, Першим українським національним конгресом з біоетики. Всі оперативні втручання, експериментальні дослідження та вихід з експерименту тварин здійснювали за умов адекватного знеболення, не завдаючи страждань останнім.

Парафінові блоки та скельця нирок щурів були виготовлені на базі відділення загальної патології КЗ «Дніпропетровське обласне патологоанатомічне бюро» для подальшого проведення імуногістохімічного (ІГХ) дослідження в морфологічному відділі діагностичного центру ООО «Аптеки медичної академії», м. Дніпропетровськ. Для проведення світлової мікроскопії використовували мікроскоп «Leika DLM-E» (США) з об’єктивами ´10, ´20, ´40, ´100. Згідно зі стандарт-ною процедурою, гістологічні зрізи 4-6 мкм наносили на адгезивні предметні скельця SuperFrost Plus, з проведенням депарафінізації, регідратації зрізів та температурного демаскування антигенів у цитратному буфері рН 6.0 з підігрівом у автоклаві при температурі +121 °С. Активність ендогенної пероксидази пригнічували 3%-вим розчином перекису водню. Інкубація зрізів з первинними антитілами відбувалася у вологих камерах при температурі 23-25 °С. В якості первинних використовувалися моноклональні антитіла до CD3 та aSMA (TermoScientific, США) (табл. 2).

Як розчинник використовували спеціальний розчин Antibody Dіluent (TermoScientific, США). Для ідентифікації реакції використовували систему візуалізації Quanto (TermoScientific, США), з нанесенням в якості хромогену 3-діа-мінобензидин тетрахлориду (DAB) (Termo-Scientific, США). Для відокремлення незабарвлених структур зрізи додатково обробляли гематоксиліном Майєра.

Розраховували CD3+ Т-лімфоцитів за мембранним забарвленням відповідного маркера в 10 полях зору (´400) і розраховували як середнє арифметичне абсолютних значень, при цьому відмічали загальну кількість імуноцитів та їхню локалізацію [7]. Кількісний і якісний склад судин уражених нирок щурів та нирок з груп порівняння оцінювали за цитоплазматичною експресією маркера м’язової диференціації aSMA при збільшенні (´200) у 10 полях зору [7].

Дані імуногістохімічних досліджень проводили статистичну обробку в програмі SPSS Statistica 17.0. Для розрахунку середніх значень використовувався t-коефіцієнт. У групах з достовірною відмінністю експресії маркера значущим вважався зв’язок при р < 0,05.

Результати та їх обговорення. Нирка щура, як однодольний однопірамідний орган, представляє безумовно цікавий об’єкт для дослідження змін місцевого кровообігу при різних патологіч-них станах, які притаманні ниркам людини. Підгрупа щурів А I (ліві нирки - ЛН), що перебувала під впливом експериментальної ішемії, при гістологічному дослідженні характеризувалася великою кількість повнокровних дилятованих судин (рис. 1, А), що мали периваскулярну набряклу строму і звивистий хід. Більшість полів зору містила екстравазальні точкові крововиливи навколо розгалуженої капілярної сітки, розташованої навколо звивистих канальців. Епітелій більшості канальців перебував у стані гідропічної дистрофії, що також було знайдено в контралатеральних правих нирках (ПН) підгрупи А II (рис. 1, Б), як і набряк строми. Це підтверджує, що судинні захворювання нирок впливають на клубочки, судини та ниркову паренхіму із канальців та інтерстицію. І хоча останні є окремими функціональними та структурними відділеннями, вони тісно пов’язані між собою, пошкодження одного неминуче призводить до пошкодження іншого.

На зрізах, забарвлених гематоксиліном-еозином (ГЕ) в уражених ЛН спостерігалися великі периваскулярні круглоклітинні запальні інфільтрати. Завдяки маркеру Т-клітинної диференціації CD3 зрозуміло, що останні представляли більшу частину імуноцитів. У середньому кількість CD3+ Т-лімфоцитів у підгрупі А I склала 62,7±1,5. Цікаво, що в поодиноких випадках розміри ділянок запалення розповсюджувалися навіть на навколониркову жирову тканину (рис. 2, А), на відміну від підгрупи А II, де запальні інфільтрати мали завжди осередковий характер і звичайно розташовувалися навколо судин, але могли бути в міжтубулярних просторах (рис. 2, Б). Ці прояви характерні для хронічного тубулоінтерстиціального нефриту. Кількість CD3+ Т-лімфоцитів в підгрупі А II у середньому склала 14,3±1,2, на відміну від контрольної групи (КГ), де Т-лімфоцити зустрічалися рідко і лише у вигляді поодиноких клітин інтерстицію на рівні 2,1±0,5 (р < 0,05) (рис. 2, Е, Є).

Хід судин та товщину їх м’язової стінки ми оцінювали за допомогою маркера aSMA, що виявляє експресію a-гладенького актину. Порушення кровопостачання (фіксоване перегинання правої ниркової артерії) у підгрупі А I ви-кликало спазм периферійних ділянок міждолькових артерій та артеріол з ішемією коркової речовини. Накопичення продуктів обміну таких, як сполуки азоту, призвело до дилатації та підвищення проникності стінок міждолькових, внутрішньодолькових артерій, вен та капілярів кортикального лабіринту, що ми і спостерігали в зразках цієї підгрупи. До того ж такі зміни судин було знайдено звичайно в осередках запалення (рис. 3, А). Слід зазначити, що підгрупа А II паралельно з цим характеризувалася помірною гіперплазією м’язових стінок судин, що добре видно при цитоплазматичній експресії маркера aSMA в гладком’язових клітинах (рис. 3, Б). Швидко за все гіперпластична реакція стінок судин «здорової» нирки виникає через підвищення артеріального тиску, внаслідок включення юкстагломерулярного механізму активації ренін- ангіотензинової системи ушкодженої нирки.

Підгрупа щурів В I (ЛН) після перетинання їхніх лівих сечоводів для моделювання захворювань, що супроводжуються уростазом, характеризувалася розвитком гідронефрозу з вираженою атрофією паренхіми і клубочкового апарату (рис. 1, В). На гістологічних зрізах спо-стерігались зменшені атрофічні канальці серед склерозованого інтерстицію, осередки хронічного запалення, з більшою частиною CD3+ Т-лімфоцитів (рис. 2, В). У середньому кількість CD3+ Т-клітин у підгрупі В I склала 54,1±0,9. Зміна співвідношення кількості канальців та клубочків призвела до порушення ангіоархітектоніки в корковій речовині - судини мали звивистий хід, надмірне скупчення або закриття просвітів через здавлення та атрофію (рис. 3, В), але потовщення стінок чи паренхіматозних крововиливів ми не спостерігали, на відміну від підгрупи А I. Стосовно патологічних змін контралатеральних ПН підгрупи В II можна виокремити периваскулярні осередки розростання сполучної тканини (рис. 1, Г), що зазвичай мали запальний інфільтрат та інтерстиційний набряк, дистрофічні зміни епітелію канальців і значне потовщення стінок судин через гіпертрофію м’язового шару (рис. 3, Г), що підтверджує наявність ренальної гіпертензії у щурів із однобічним уростазом. CD3+ Т-лімфоцити спостерігалися нами і в периваскулярній сполучній тканині, і в перитубулярних інтерстиціальних проміжках (рис. 2, Г), у середньому на рівні 16,9±1,1, що вірогідно відрізнялось від КГ (р < 0,05).

Нирки підгрупи щурів С I (ЛН), які мали обидва патологічні процеси, зазнавали найбільших та найтяжчих патологічних змін паренхіми (рис. 1, Ґ, Д), що поєднували гідронефроз, склероз, запалення (рис. 2, Ґ) з ураженням судин (дилатація, крововиливи, інтерстиційний набряк, значне порушення ангіоархітектоніки (рис. 3, Ґ), на відміну від контрольної групи (рис. 3, Е, Є). CD3+ Т-лімфоцити налічувалися в середньому близько 58,9±1,1. Контралатеральні ПН підгрупи С II показали ті ж патологічні зміни, що були притаманні ПН попередніх груп - інтерстиційний набряк, осередковий склероз, парен-хіматозні крововиливи (рис. 1, Е), потовщення м’язових шарів артерій та артеріол. Вміст CD3+ Т-лімфоцити в ділянках хронічного запалення коливався в межах 10,9±0,8, що також показало вірогідну різницю з КГ (р < 0,05) (рис. 2, Д).

Дослідження процесів проліферації та апоптозу за допомогою імуногістохімічних маркерів в ушкоджених та контралатеральних «здорових» нирках щурів при експериментально змодельованих однобічних патологічних станах, які призводять до порушення місцевого кровотоку, є перспективним напрямком подальших розробок.

Висновки

1. Таким чином, при однобічному ураженні нирок щурів, внаслідок експериментальної ішемії, або порушення уродинаміки, або обох цих патологічних станів разом, що завдають шкоди місцевому нирковому кровотоку, в інших контралатеральних «здорових» нирках виникають патологічні зміни ще до проведення нефректомії, і це свідчить про необхідність їх медикаментозної підтримки.

2. Основні патологічні прояви в правих контралатеральних «здорових» нирках досліджуваних груп щурів проявлялися в наявності дистрофічних змін епітелію канальців, осередків набряку та склерозу навколо крупних судин, перитубулярних та периваскулярних круглоклітинних запальних інфільтратів із вмістом CD3+ Т-клітин (для підгрупи А II - 10,3±1,2, для В II - 11,9±1,1, для С II - 10,9±0,8), що вірогідно відрізнялися від контрольної групи (р < 0,05), де CD3+ Т-лімфоцити зустрічалися у вигляді поодиноких клітин інтерстицію на рівні 2,1±0,5.

3. Гіпертрофія гладком’язових клітин стінок артерій та артеріол правих контралатеральних «здорових» нирок досліджуваних груп щурів, порівняно з контрольною групою, підтверджує наявність ренальної гіпертензії, що виникає при односторонньому ураженні нирок у змодельованих патологічних станах.