В.П. Стусь, I.С. Шпонька, В.О. Бондарєва, В.М. Краснов

Морфолого-морфометричні зміни в нирках вагітних самиць щурів при дії солей важких металів та можливості протекторного ефекту нанометалів

Вступ. Одним із провідних питань нині є вивчення впливу солей важких металів на стан органів і тканин людин і тварин. Їх з’єднання не руйнуються в µрунті, воді та рослинах. Головна небезпека важких металів полягає в тому, що вони здатні поступово концентруватися в харчових ланцюгах і, таким чином, більшою чи меншою мірою впливати на організм людини. Потрапляючи в організм людини навіть у невеликих дозах, сполуки накопичуються в ньому і практично самостійно не виводяться [4, 5]. Вони можуть тривалий час зберігатися в об’єктах навколишнього середовища, мігрувати, накопичуватися в організмі людини і тварин, викликаючи морфофункціональні зміни в органах і тканинах [3, 12]. У числі цих сполук одне з перших місць посідає свинець та його модифікаційні форми [7, 13].

Відомо, що свинець та його солі належать до токсинів політропної та поліпатогенетичної дії. Він здатний кумулюватися в організмі, ви-кликаючи широкий спектр негативних ефектів: пригнічення кровотворної функції, нервової, травної, видільної та інших систем [11, 16]. Така здатність до поліорганного ушкодження призвела до ініціації багатьох досліджень із використанням солей вказаного металу та наступною оцінкою глибини змін тканин та розробки можливих заходів щодо пом’якшення дії чинника, або, оптимально, нівелювання його ефекту [9, 17, 22]. Найбільш чутливими до впливу свинцю є діти, які в силу морфофункціональної незрілості відрізняються підвищеною чутливістю до антропогенних впливів протягом усього періоду росту, в тому числі і у внутрішньоутробному розвитку [12, 18, 27].

Поєднання солей свинцю є одними з найстаріших відомих токсинів, особливо у випадках із підозрою на умисне отруєння - так, за даними Gidlow D.A., 2012 [13] перші маніфестні дані щодо отруєння свинцем були описані понад 5000 років тому. Найбільш токсичними на даний момент вважаються органічні (тетраетил свинцю) та неорганічні сполуки (ацетат свинцю). Вказані сполуки використовуються у медичних галузях, художньому мистецтві, при бу-дівництві трубопроводів, виробництві тютюну та сигар, обробці технічних матеріалів тощо [8, 12]. На перший погляд, найбільш уразливими до дії сполук свинцю є безпосередні шляхи потрапляння поєднань свинцю - респіраторний та шлунково-кишковий тракти, але також суттєво вражаються органи, здатні до детоксикації (нирки, печінка), недостатність яких вже викликає в організмі так звану «токсичну бурю» [14, 15].

Характерними рисами металевої нефротоксичності є переважна локалізація патоморфологічних змін у конкретних ділянках проксимальних канальців і клубочків нирок [19, 23]. Це передбачає, що саме ці фрагменти нефрона можуть бути вибірково чутливі до конкретних металів. Така вибіркова зміна чутливості до металів може пояснюватися локалізацією транспортної системи та осередками молекулярного зв’язування лігандів [20, 26].

Незважаючи на значний прогрес, який був досягнутий у виявленні різних позаклітинних, мембранних і внутрішньоклітинних лігандів, що відіграють важливу роль у розвитку механізмів нефротоксичності, багато питань етіопатогенетичного пошкодження нирок залишаються досить суперечливими та потребують подальших досліджень.

Матеріали та методи дослідження. Для проведення експериментальних досліджень було обрано самиць щурів лінії УІ5Іаг (розплід- ник - «Далі-2001»). Після адаптаційного періоду, який складав 12 днів, тварин зі стійким ритмом естрального циклу у віці 3-3,5 міс., з масою тіла 170-200 г у кількості 70 в стадії проеструс і еструс парували з інтактними самцями за схемою 2:1. Перший день вагітності визначали за наявністю сперматозоїдів у піхвових мазках.

У експерименті використано методичні підходи, що відповідають Закону України «Про захист тварин від жорстокого поводження» та Загальним етичним принципам експериментів на тваринах [2, 3, 6, 25], що узгоджуються із міжнародними вимогами щодо проведення токсиколо-гічних експериментів з використанням тварин у відповідності до Європейської конвенції. Тварин утримували в оптимальних умовах віварію на стандартному раціоні із вільним доступом до води та їжі відповідно до існуючих вимог.

В експериментальних моделях використовували розчини неорганічних солей металів - ацетату свинцю та хлориду цинку, а також колоїдні розчини цитратів вказаних металів, отриманих за новітньою авторською технологією в науково-дослідному інституті Нанобіотехнологій та ресурсозбереження України (патент України № 49050, спосіб Каплуненка-Косінова отримання карбоксилатів з використанням нанотехнології). Моделювання впливу металів та нанометалів на нирки вагітних самиць щурів проводили шляхом введення розчинів досліджуваних металів у шлунок через зонд одноразово, в один і той же час, з 1-го по 19-й день вагітності.

Самиць щурів з датованим терміном вагіт-ності розподілили на 7 груп, з яких 6 - дослідних (по 8 самиць у кожній групі), яким вводили препарати ізольовано (1-ша група - ацетату свинцю у дозі 0,05 мг/кг, 2-га група - хлорид цинку у дозі 1,5 мг/кг, 3-тя група - цитрат цинку, отриманий за нанотехнологією у дозі 1,5 мг/кг, 6-та група - цитрат свинцю, отриманий за нанотехнологією у дозі 0,05 мг/кг) та в комбінації (4-та група - ацетат свинцю та хлорид цинку, 5-та група - ацетат свинцю та наноцинк) і одна (7-ма група) - контрольна, яка отримувала дистильовану воду.

Тварин виводили із експерименту на 20-ту добу під тіопенталовим наркозом. Після виділення матки з рогами та ембріонів вилучали внутрішні органи, зокрема нирки. Частину нирок фіксували в 10%-вому нейтральному формаліні. Після стандартного гістологічного проведення в спиртах зростаючої концентрації матеріал просвітляли в ксилолі, заливали в парафіновий блок для подальшого мікроскопічного дослідження. Іншу половину матеріалу заморожували для подальшого визначення вмісту важких металів.

Після фіксації матеріал зневоднювали проведенням крізь батарею розчинів етилового спирту з підвищенням концентрації: 70% - 80% - 90% - 96% - 100%-1 - 100%-2. Час перебування в спиртах залежав від об’єму тканини. Для органів щурів було досить витримувати по годині в кожному розчині спирту. Після зневоднення зразки витримували у суміші 100%-вий спирт + хлороформ (1:1), у 3 змінах чистого хлороформу, після цього занурювали у 2 змінах суміші хлороформу + парафіну (у співвідношенні 1:1). Першу зміну витримували при температурі 37 °С, другу - при температурі 56 °С по 0,5 год. У кінці зразки заливались парафіном та витримувались по 1 год при температурі 56 °С. Потім форми із зразками в парафіні поступово охолоджували при кімнатній температурі протягом 5 хв., при +4 °С - 10 хв., при -20 °С - 10 хв. Поступове охолодження блоків дозволяло уникнути утворення тріщин у парафіні.

Для отримання зрізів використовували мікротом зі станцією прийому зрізів (Microm HM-340), що дозволило готувати серійні зрізи товщиною 4 мкм. Із мікротому готові зрізи потрапляли у станцію прийому з температурою води +37 °С, де вони розправлялися. Потім зрізи переносили на адгезоване предметне скло та залишали у термостаті при 37 °С протягом 5- 10 хвилин.

Після депарафінізації у ксилолі та регідратації у батареї розчину етанолу (100%-1, 100%-2, 96%, 90%, 80%, 70%), зрізи промивалися дис- тильованою водою та забарвлювалися за допомогою гематоксиліну Майєра 5 хв. (забарвлення ядер) з наступним промиванням у проточній воді з метою диференціювання тканин та розчином еозину протягом 1 хв. (забарвлення цитоплазми) згідно зі стандартним протоколом. Забарвлені зрізи знову дегідратували за вище-вказаною схемою та заключали у бальзам або полістирол та накривали покровним склом.

Мікроскопічне дослідження виконувалося за допомогою світлового мікроскопа Leіca DMLS із використанням об’єктивів ´10, ´20, ´40, ´100.

Морфометричний аналіз проводили за допомогою методу Кавальєрі, який використовується для оцінки як абсолютного обсягу нирки, так і обсягу окремих ниркових фракцій: коркової речовини, мозкової речовини, клубочків, проксимальних та дистальних канальців [1, 10, 21]. Згідно із рекомендаціями Nejdet Simsek et al., 2009 [24], для дослідження були взяті зрізи нирки і дві рахункові решітки, що є прозорими пластинами з нанесеними в певному порядку крапками, щільність яких повинна бути не менше 100 / см2. Решітка №1 відрізняється більшою щільністю нанесення крапок і дозволяє оцінити об’ємну частку складових частин кожного нефрона. Решітка № 2 має меншу щільність нанесення крапок і служить для визначення співвідношення окремих шарів нирки. У ході дослідження дані рахункові решітки прикладалися з певною закономірністю до різних ділянок кожного зрізу. Даний метод дозволяє обчислити також коефіцієнт можливої помилки і коефіцієнт варіабельності для отримання більш точних даних. Обсяг основних структур кожного зрізу оцінювався за допомогою наведеної формули:

V = t ´ a/p ´ P,

де V - фактичний обсяг досліджуваного об’єкта, t - товщина зрізу, a/p - кількість точок у полі зору решітки в залежності від досліджуваних структур (решітка № 1 або № 2), P - загальна кількість крапок решітки в полі зору.

Дана формула застосовувалася для кожного зрізу, в результаті чого за сумою отриманих обсягів визначався загальний обсяг органів (V1 + V2 + ... = SV).

Фракційний обсяг для ділянок досліджуваних зрізів визначався шляхом співвідношення кількості крапок, що покривають об’єкт до загальної суми крапок, що припадають на окремий зріз [25, 28].

Усі отримані в роботі цифрові дані обробляли комп’ютерними програмами Місгоsoft Ехсеl, Statitica 10. Значимість відмінностей між досліджуваними ознаками оцінювали за допомогою параметричних та непараметричних методів статистики. Достовірність відмінностей визначали за 1-критерієм Стьюдента. Достовірними вважали відмінності при р<0,05.

Результати та їх обговорення. За нашими даними макроскопічних виражених змін у розташуванні, формі та вигляді нирок інтактних та експонованих тварин не було виявлено. Нирки мали типову анатомічну будову, капсула знімалася без видимих зусиль, на розрізі досить чітко візуалізувались коркова та мозкова речовина. Але при проведенні гістологічних досліджень було виявлено, що найбільш патоморфологічно ушкодженими були щури із груп, які отримували солі важких металів у комбінації, а саме - ацетат свинцю + хлорид цинку (4-та група) та ацетат свинцю + наноцинк (5-та група) (таблиця 1).

У результаті проведеного дослідження нами було встановлено, що найбільш значущі зміни середнього об’єму коркової речовини нирки спостерігались у щурів 4-ї та 5-ї груп (590 та 625 мм3 відповідно), які майже в два рази були меншими за нормальні розміри (приблизно 1280 мм3), що свідчить про надзвичайно токсичну дію сполук ацетату свинцю з хлоридом цинку та ацетату свинцю з наноцинком, кращими виявились показники 1-ї та 6-ї груп (915 та 1032 мм3), відомо, що на цих щурів діяли ацетатом свинцю та сполукою ацетату свинцю з наносріблом, що є менш токсичними порівняно з попередніми хімічними речовинами (рис. 1).

Слід зазначити, що у щурів 2-ї та 3-ї груп, яким вводили хлорид цинку та тільки наноцинк, показники об’єму коркової речовини майже не відрізнялись від показників контрольної групи (1200 та 1230 мм3), отже, дані сполуки виявились найменш токсичними за дією на ви-дільну систему.

Схожі висновки можна отримати також під час дослідження змін об’єму мозкової речовини, де в три рази меншими за показники контрольної групи (у середньому 410 мм3) виявились результати 4-ї та 5-ї груп (590 та 625 мм3 відповідно), найближчими до норми були показники 2-ї та 3-ї груп, які склали 350 та 390 мм3, що підтверджує встановлену вище закономірність (рис. 2).

Цікавим є спостереження змін загального об’єму проксимальних канальців нефронів до-сліджуваних щурів, який у контрольної групи сягав приблизно 395 мм3, проте у 4-й та 5-й групах під дією надзвичайно токсичних ацетату свинцю з хлоридом цинку та ацетату свинцю з наноцинком зменшився більше ніж у 4 рази та досяг позначки 75 та 90 мм3 відповідно, що свідчить про катастрофічні зміни у клітинах проксимальних канальців експериментальних тварин (рис. 3). Відомо також, що чистий ацетат свинцю та сполука ацетату свинцю з наносріблом виявили менш пагубний вплив на нирки, оскільки у групах 1 та 6 показники знизилися лише у 2 рази порівняно з нормою (175 та 190 мм3). Щодо дії хлориду цинку та наноцинку, можна сміливо стверджувати про те, що ці сполуки мають менш токсичний вплив на видільну систему, що пояснюється відносною стабілізацією мембран клітин із використанням нанотехнологій у 2-й та 3-й групах.

Схожими є зміни, що відбулись у дистальних канальцях нефронів, де суттєво, приблизно у 6 разів, змінились показники тих самих 4-ї та 5-ї груп і досягли 40 та 65 мм3 відповідно, а тому ми можемо стверджувати про необоротні зміни у нирковій тканині саме у цих двох групах. Значно кращими виявились показники груп, які отримували ацетат свинцю та його сполуку з наносріблом. Було встановлено, що загальний об’єм дистальних канальців зменшився лише в два рази (160 та 135 мм3) порівняно з об’ємом канальців контрольної групи. Досить оптимістичними є дані, отримані у 2-й та 3-й групах при введенні в організм хлориду цинку та наноцинку відповідно (190 та 220 мм3), вони свідчать про майже нетоксичний вплив на організм тварини на відміну від застосованих раніше шкідливих сполук (рис. 4).

Аналізуючи отримані результати, слід звернути увагу на зміни діаметра проксимальних і дистальних канальців, а також його співвідношення з діаметром просвіту досліджуваного канальця. Відомо, що діаметр проксимального канальця нефрона будь-якої тварини більше діаметра дистального канальця та у нормі становить приблизно 35,5 мкм, тоді як діаметр просвіту канальця складає в середньому 19,25 мкм (рис. 5, 6).

Показовим є те, що у групах щурів, яким було введено ацетат свинцю з хлоридом цинку та ацетат свинцю з наноцинком, окрім зменшення діаметра самого канальця (17,54 та 17,72 мкм) спостерігається відповідне розширення діаметра просвіту канальця (10,45 та 10,7 мкм). Такі зміни можна вважати наслідком некрозу та десквамації епітелію просвіту канальців під дією токсичних речовин. Дещо краща картина спостерігається у групах, які одержали чистий ацетат свинцю та ацетат свинцю з наносріблом (18,98-11,23 мкм та 23,26-12,27 мкм), де також можна простежити певну тенденцію до збільшення просвіту канальця при загальному зменшенні діаметра, обумовлені дистрофічними та некротичними змінами епітеліоцитів. Проте не кожен каналець відрізняється розширеним просвітом. Можемо бачити різке зменшення діаметра просвіту канальця у випадках його запального набряку, що також спостерігається у змінених нефронах. На фоні попередніх груп, 2-га та 3-тя, виділяються більшою довжиною діаметра проксимальних канальців разом із пропорційними змінами у величині діаметра просвіту цих канальців (21,67-13,3 мкм та 22,48-13,7 мкм), що відображає настання тільки дистрофічних змін без супутніх некрозу та десквамації.

Наведені вище твердження µрунтуються також на зміні значення та співвідношення загального діаметра з діаметром просвіту дистального канальця, що у нормі наближуються до 21,7 мкм та 11,95 мкм відповідно. За даними дослідження, найбільш катастрофічні зміни відбулися у групах 4 та 5, де разом із значним зменшенням загального діаметра канальця (8,73 та 8,96 мкм) спостерігається непропорційне розширення просвіту канальця (5,45 та 5,9 мкм), також обумовлене некрозом і десквамацією епі-телію. Менші зміни бачимо у групах 1 та 6, де патологічні зміни не досягли такої високої межі (11,76-6,9 мкм та 15,59-7,21 мкм). Цікавим для нас є те, що у групах щурів, яким було введено хлорид цинку та наноцинк, показники діаметрів (16,45-6,5 мкм та 18,02-7,1 мкм) дуже близькі до показників контрольної групи, що свідчить про досить низьку токсичність використаних хімічних сполук.

Щодо морфологічних змін у нирках при інтоксикації сполуками, які містять важкі метали, відомо, що нирки є одними з головних органів, здатних до детоксикації з одного боку, але з найбільш вразливих - з іншого, тому відновлення їх функції є базисом відновлювальної таргетної терапії.

В обох групах із використанням комбінації ацетату свинцю + хлорид цинку (4-та група) та ацетату свинцю + наноцинк (5-та група) спосте-рігались внутрішньоядерні включення, особливо у клітинах епітелію проксимальних канальців. Патоморфологічні зміни у нирках (рис. 7) демонстрували дегенеративні процеси різного ступеня тяжкості - від гіаліново-крапельної дистрофії та гідропічної дистрофії до гострого тубулярного некрозу, який супроводжувався наявністю запального інфільтрату, здебільшого у канальцях кортикального шару нирок. Епітелій у канальцях та ниркових клубочках був із набряком та накопиченням піноцитозних везикул. Явища вираженого венозного повнокрів’я мали місце як фокально - у зоні переходу коркової речовини нирок у мозковий шар, так і безпосередньо проміж найбільш ураженими канальцями. Також спостерігався набряк ендотелію у гломерулярному апараті. По мірі десквамації епітелію із деструкцією ядер у проксимальних та дистальних канальцях коркового шару нирки мало місце потовщення ендотелію базальної мембрани у клубочках, що свідчило про активацію компенсаторних процесів із піноцитозом внаслідок зниження реабсорбтивної функції канальців. Такі зміни було відмічено одномоментно у різних кластерах нефрону, тобто, не всі ділянки уражались у той же самий час, що пояснюється перерозподілом функціонального напруження різних ділянок самої нирки.

Висновки

1. При дії на нирки токсичних сполук важких металів морфологічні зміни спостерігаються у всіх структурах органа, не тільки в епітелії проксимальних та дистальних канальців, але й у ниркових клубочках.

2. Найбільш вразливий ефект на епітелій канальців нирок експериментальних тварин спостерігався при комбінації дії молей важких металів, а саме - ацетату свинцю та хлориду цинку.

3. Кращі результати за всіма показниками були отримані у групах тварин, які підлягали дії токсичних сполук із використанням нанометалів, що свідчить про проективний ефект нанотехнологій завдяки стабілізації мембран.