С.В. Базалицька

Убіквітин-протеолізна система в патогенезі чоловічої неплідності після аварії на ЧАЕС

Постійне зростання кількості неплідних шлюбів в Україні в останні десятиріччя свідчить, з одного боку, про суттєві медико-соціальні проблеми в країні, а з іншого - про можливий негативний вплив факторів зовнішнього середо­вища, зокрема - іонізуючого опромінення, на генеративну функцію чоловіків. У 2004 році було відкрито новий механізм внутрішньоклітинного розщеплення білків, який дістав назву убіквітин­опосередкованого, за що авторам Аарону Чехановеру та Авраму Гершко було присуджено Нобелівську премію. Це відкриття в подальшому дозволило встановити, що порушення внутрі­шньоклітинного убіквітин-протеасомного проте­олізу відіграють значну роль в патогенезі багатьох захворювань людини: при спадкових хворобах, дистрофічно-дегенеративних захворю­ваннях, канцерогенезі. Оскільки система внутрі­шньоклітинного протеолізу задіяна в процесах розвитку та диференціації клітин, проліферації клітин, реакціях клітин на стрес та пошкод­ження, а також в процесі неоплазії [1].

В сучасних дослідженнях виявлено, що інактивація ubiquitin protein ligase, локалізованої в чоловічих статевих клітинах, призводить до блокування сперматогенезу та розвитку неплід­ності [2,3,4]. Враховуючи це, можна передба­чити, що структурні та функціональні пошкод­ження компонентів убіквітин-протеасомної си­стеми можуть відігравати значну роль в патоге­незі чоловічої неплідності різної етіології, і, зокрема, при дії іонізуючого опромінення.

Мета дослідження - вивчити імуногісто­хімічні особливості експресії протеїну Ubiquitin у хворих на різні форми чоловічої неплідності, які проживають у «чистих» та забруднених ра­діонуклідами 137Cs районах України.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Досліджено матеріал 54 хворих із азооспермією, отриманий під час інцизійної біопсії, з наступним гістологічним та імуногісто­хімічним дослідженням біоптату.

Для встановлення клінічного діагнозу фор­ми неплідності користувались загальноприй­нятою класифікацією [5]. При визначенні за­ключного діагнозу враховували дані морфоло­гічного дослідження біоптату яєчка та резуль­тати гормональних досліджень. При розподілі хворих на групи, враховували місце їх прожи­вання згідно документу [6]. Відповідно, виділяли пацієнтів, які проживають на забруднених радіо­нуклідами 137Cs територіях України, що зазначені у згаданому документі; та пацієнтів із «чистих» регіонів, дані про які відсутні у зазначеному документі. Згідно встановленого діагнозу і місця проживання пацієнтів було розділено на три групи:

1 група - 17 хворих, у яких було вста­новлено діагноз екскреторно-обтураційної не­плідності. Серед хворих цієї групи 11 пацієнтів - із «чистих» районів, і 6 - із забруднених радіонуклідами 137Cs регіонів. Середній вік хворих складав 33,6 років.

2 група - 26 пацієнтів, у яких було встановлено діагноз секреторної неплідності із блоком сперматогенезу на рівні сперматогоній, сперматоцитів 1 і 2 порядку чи сперматид. Серед хворих цієї групи 12 пацієнтів - із «чистих» районів та 14 хворих - із забруднених радіо­нуклідами 137Cs регіонів України. Середній вік хворих складав 29,5 років.

3 група - 11 пацієнтів із синдромом «лише клітини Сертолі». Серед хворих цієї групи 5 пацієнтів - із «чистих» районів та 6 хворих - із забруднених радіонуклідами 137Cs регіонів України. Середній вік хворих складав 28,5 років.

Для гістологічного дослідження біоптати тканини яєчка фіксували в рідині Буена і зали­вали в парафін. Із парафінових блоків виготов­ляли зрізи завтовшки 5мкм, які фарбували гема­токсилін-еозином.

Імуногістохімічний аналіз здійсювався з використанням стандартного звідин-біотинового методу. Для ІГХ дослідження біоптати фіксували у 12% формаліні, заливали в парафін і виготов­ляли зрізи. Після депарафінізації в ксилолі і дегідратації в батареї спиртів, зрізи для блокади активності ендогенної пероксидази вміщували на 5 хвилин у 0,3% розчин перекису водню, розве­деному на фосфатному буфері (рН 7,4). Після промивання дистильованою водою зрізи інкубу­вали у мікрохвильовій печі при температурі 98.С в 0,1М цитратному буфері (pH 6,0) протягом 30 хвилин, потім негайно охолоджували. Далі зрізи преінкубували протягом 15 хвилин у 1% розчині конячого сироваткового альбуміну, розведен­ному на фосфатному буфері, після чого інкубу­вали з первинними антитілами Ubiquitin в розве­денні 1:800 протягом 18 годин при температурі 4.С. Із вторинними мишачими моноклональними антитілами зрізи інкубували у вологій камері 30 хвилин при кімнатній температурі. Авідин-біо­тиновий комплекс (АВС) (DAKO, Glostrup, Да­нія) готувався за 30 хвилин до використання. Після того зрізи інкубували в АВС 30 хвилин при кімнатній температурі. Кожний етап закін­чувався триразовим промиванням по 5 хвилин у фосфатному буфері. В кінці, після проявлення 1­2 хвилини у 0,05% розчині диамінбензидину (DAB) (Sigma Chemicals, США), зрізи дофарбо­вували гематоксиліном та заключали в ка­надський бальзам.

Як позитивний контроль використовували зрізи тканин із відомим заздалегідь високим вмістом протеїну Ubiquitin. Ті ж зрізи служили як негативний контроль, але без обробки первин­ними антитілами.

В кожному випадку для імуногістохімії аналізували 12-16 зрізів. Розповсюдженість та інтенсивність ІГХ реакції оцінювали за напів­кількісним методом в балах [7]. Розповсюд­женість реакції або кількість забарвлених ядер чи цитоплазми клітин оцінювали від 0 до 3 балів за такими критеріями: 0 - відсутність клітин із ви­димим забарвленням, 1 - забарвлено менше 10% клітин, 2 - забарвлено більше 10%, але менше 50% клітин, 3 - рівномірно забарвлено більше 50% клітин клітинного шару. Інтенсивність за­барвлення ядер або цитоплазми оцінювали за такими критеріями: 0 - відсутність видимого забарвлення, 1 - слабко забарвлені ядра або ци­топлазма, 2 - помірно забарвлені ядра або ци­топлазма, 3 - інтенсивно забарвлені ядра або ци­топлазма. Загальний результат ІГХ реакції визна­чався за показниками імуногістохімічного коефі­цієнта (ІГХК) від 0 до 9 балів, який одержували перемножуванням оцінок розповсюдженості та інтенсивності забарвлення. Проводився статис­тичний аналіз отриманих результатів.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

При дослідженні імуногістохімічної екс­пресії протеїну Ubiquitin в групі хворих на екскреторно-обтураційну неплідність із збере­женим сперматогенезом із «чистих» регіонів в клітинах Сертолі спостерігалось слабке ядерне зафарбування (ІГХК:1-3) в 4 спостереженнях (45%), в шести випадках (55%) спостерігалось помірне ядерне зафарбування (ІГХК:4-6). Се­реднє значення ІГХК дорівнювало 5,1±0,45.

Цитоплазматична експресія протеїну Ubiquitin в клітинах Сертолі була слабкою (ІГХК: 1-3) в усіх випадках (100%). Середнє значення ІГХК дорівнювало 2,7 ±0,09.

Клітини сперматогенного епітелію - спер­матогонії, сперматоцити 1 і 2 порядку, спер­матиди - виявляли слабку ядерну та цитоплазма­тичну експресію протеїну Ubiquitin в усіх спосте­реженнях (100%) даної групи, ІГХК, при цьому, становив 2-3 бали. Середнє значення ІГХК дорівнювало 2,3 ±0,09 та 2,2 ±0,09 відповідно. Необхідно зазначити, що зрілі сперматозоїди характеризувались відсутністю імуногістохіміч­ної експресії протеїну Ubiquitin (ІГХК: 0) в усіх випадках (100%).

В клітинах Лейдіга помірна ядерна екс­пресія в 6 балів спостерігалась у 3 випадках (27%); в 6 спостереженнях (54,5%) виявлялось слабке ядерне зафарбування (ІГХК: 1-3) та в 2 спостереженнях (18%) ядерна експресія протеїну Ubiquitin була відсутня (ІГХК: 0). Середнє зна­чення ІГХК дорівнювало 4,3 ±0,54. Слабка ци­топлазматична експресія убіквітину (ІГХК: 2-3) визначалась в 9 випадках (81%) даної групи (Рис. 1) та була відсутня в 2 випадках (19%) (ІГХК:0). Середнє значення ІГХК дорівнювало 2,7 ±0,27 (Табл.).

В групі хворих на секреторну неплідність із блоком сперматогенеза на рівні сперматогоній, сперматоцитів 1 і 2 порядку чи сперматид (всьо­го 12 пацієнтів) в клітинах Сертолі спостері­галось помірне ядерне зафарбування (ІГХК:4-6) в усіх 12 спостереженнях (100%). Середнє значення ІГХК дорівнювало 5,8 ±0,17. Цитоплазматична експресія протеїну Ubiquitin в клітинах Сертолі була слабкою (ІГХК:2-3) в 4 випадках (33,3%) та помірою (ІГХК:4-6) - у 8 випадках (66,7%). Середнє значення ІГХК дорівнювало 4,8±0,17.

Клітини сперматогенного епітелію - сперматогонії, сперматоцити 1 і 2 порядку, сперматиди виявляли слабку ядерну та цитоплазматичну експресію протеїну Ubiquitin в усіх спостереженнях (100%) даної групи, ІГХК, при цьому, становив 1-3 бали. Середнє значення ІГХК в ядрі та цитоплазмі дорівнювало, відповідно, в сперматогоніях - 2,1 ±0,17 та 2,2 ±0,17; в сперматоцитах - 2,1 ±0,17 та 1,9 ±0,17; в сперматидах - 2,6 ±0,17.

В клітинах Лейдіга ядерна експресія протеїну Ubiquitin була відсутня (ІГХК: 0) в 9 спостереженнях (75%), та в 3 випадках (25%) була слабкою (ІГХК: 1-3). Середнє значення ІГХК дорівнювало 0,3 ±0,16. При цьому, в 6 випадках (50%) спостерігалось слабке цитоплазматичне зафарбування (ІГХК: 2-3), в інших 6 спостереженнях (50%) - мало місце помірне цитоплазматичне зафарбування інтерстиційних ендокриноцитів (ІГХК: 4-6) (Рис.2). Середнє значення ІГХК дорівнювало 4,9 ±0,08 (Табл.).

В групі хворих на секреторну неплідність ­із синдромом «лише клітини Сертолі» (всього 5 пацієнтів) - в клітинах Сертолі спостерігалось помірне ядерне зафарбування (ІГХК: 4-6) в усіх спостереженнях (100%). Середнє значення ІГХК дорівнювало 5,9 ±0,4.

Цитоплазматична експресія протеїну Ubiquitin в сустентоцитах була помірною (ІГХК:6) в 3 випадках (60%) та виразною в двох спостереженнях (40%). Середнє значення ІГХК становило 7,4 ±0,6.

В клітинах Лейдіга ядерна експресія убіквітину була відсутня (ІГХК: 0) в 4 спостережен­нях (80%), в одному випадку (20%) визначалось слабке ядерне зафарбування (ІГХК: 1). Середнє значення ІГХК дорівнювало 0,3±0,2. При цьому, в 4 випадках (80%) спостерігалось помірне цито­плазматичне зафарбування (ІГХК: 4-6) та в од­ному випадку (20%) визначалась слабка цито­плазматична експресія (ІГХК: 3) (Рис.3). Середнє значення ІГХК дорівнювало 5,6±0,6 (Табл.).

Таким чином, імуногістохімічне дослід­ження протеїну Ubiquitin у хворих із «чистих» регіонів України виявило достовірне підвищення його цитоплазматичної експресії в клітинах Сертолі при секреторній неплідності та синдромі «лише клітини Сертолі», порівняно із ексре­торно-обтураційною неплідністю; а також посилення цитоплазматичної експресії з одно­часним зменшенням його ядерної експресії в ітерстиційних ендокриноцитах - клітинах Лейдіга при секреторній формі чоловічої неплід­ності, порівняно із екскреторно-обтураційною неплідністю.

При дослідженні імуногістохімічної екс­пресії убіквітину в групі хворих на екскреторно­обтураційну неплідність із збереженим сперма­тогенезом, які мешкали в забруднених радіо­нуклідами 137Cs регіонах України (всього 6 паці­єнтів), в клітинах Сертолі спостерігалось помірне ядерне зафарбування (ІГХК:6) в 4 спосте­реженнях (66,5%), в двох випадках (33,5%) було виявлено виразну ядерну експресію убіквітину (ІГХК: 9). Середнє значення ІГХК дорівнювало 6,8 ±0,5. Цитоплазматична експресія убіквітину в клітинах Сертолі була слабкою (ІГХК: 3) в 2 випадках (33,5%) та помірною (ІГХК: 4-6) у 4 пацієнтів (66,5%). Середнє значення ІГХК дорів­нювало 5,3 ±0,5.

Клітини сперматогенного епітелію - сперматогонії, сперматоцити 1 і 2 порядку, спер­матиди - виявляли слабку ядерну експресію убіквітину в усіх спостереженнях (100%) даної групи, ІГХК становив 2-3 бали. Середнє значен­ня ІГХК, при цьому, дорівнювало 2,8 ±0,17. Цитоплазматичне зафарбування було слабким із ІГХК в 2-3 бали у 4 випадках (66,5%) та помір­ним (ІГХК: 4-6) в 2 спостереженнях (33,5%). Середнє значення ІГХК, при цьому, дорівнювало 3,2±0,33. Необхідно зазначити, що і в даній групі зрілі сперматозоїди характеризувались відсут­ністю імуногістохімічної експресії убіквітину (ІГХК: 0) в усіх випадках (100%).

В клітинах Лейдіга в 1 спостереженні (16,5%) виявлялось слабке ядерне зафарбування (ІГХК: 3) та в 5 спостереженнях (83,5%) - ядерна експресія убіквітину була відсутня (ІГХК: 0). Середнє значення ІГХК дорівнювало 1,51±0,5. Слабка цитоплазматична експресія убіквітину (ІГХК: 2-3) визначалась в 3 випадках (50%) даної групи, в 3 спостереженнях (50%) було виявлено помірну цитоплазматичну експресію (ІГХК: 4-6). Середнє значення ІГХК дорівнювало 4,6±0,67 (Рис.4) (Табл.).

В групі хворих на секреторну неплідність із блоком сперматогенеза на рівні сперматогоній, сперматоцитів 1 і 2 порядку чи сперматид, які мешкали в забруднених регіонах України (всього 14 пацієнтів), в клітинах Сертолі спостерігалось помірне ядерне зафарбування (ІГХК:4-6) в 7 спостереженнях (50%) та у 7 випадках визна­чалась виразна ядерна експресія (ІГХК:8-9). Се­реднє значення ІГХК дорівнювало 6,9 ±0,36. Ци­топлазматична експресія убіквітину в клітинах Сертолі була помірною (ІГХК:4-6) в усіх 14 ви­падках (100%). Середнє значення ІГХК дорівню­вало 5,8 ±0,14.

Клітини сперматогенного епітелію - спер­матогонії, сперматоцити 1 і 2 порядку, сперма­тиди - виявляли слабку ядерну експресію убі­квітину в усіх спостереженнях (100%) даної гру­пи, ІГХК, при цьому, становив 2-3 бали. Середнє значення ІГХК дорівнювало 2,8±0,07. Цитоплаз­матичне зафарбування було слабким із ІГХК в 3 бали у 7 випадках (50%) та помірним (ІГХК: 4-6) в 7 спостереженнях (50%). Середнє значення ІГХК дорівнювало 3,6 ±0,07 - в цитоплазмі спер­матогоній, та 4,5 ±0,21 - в цитоплазмі спермато­цитів та сперматид.

В клітинах Лейдіга ядерна експресія убі­квітину була відсутня (ІГХК: 0) в усіх спосте­реженнях (100%), при цьому, в 13 випадках (93%) спостерігалось помірне цитоплазматичне зафарбування (ІГХК: 4-6) та в одному спосте­реженні (7%) виявлено слабку цитоплазматичну експресію в 3 бали. Середнє значення ІГХК до­рівнювало 5,5 ±0,07 (Рис.5) (Табл.).

В групі хворих на секреторну неплідність із синдромом «лише клітини Сертолі», які мешкали в забруднених радіонуклідами регіонах України (всього 6 пацієнтів), в клітинах Сертолі спостерігалось виразне ядерне зафарбування (ІГХК: 8-9) в усіх спостереженнях (100%). Цито­плазматична експресія убіквітину в сустентоци­тах була помірною (ІГХК:6) в 3 випадках (50%) та виразною в трьох спостереженнях (50%). Се­реднє значення ІГХК дорівнювало 7,8 ±0,5.

В клітинах Лейдіга ядерна експресія убі­квітину була відсутня (ІГХК: 0) в 6 спосте­реженнях (100%), при цьому, в усіх 6 випадках спостерігалось помірне цитоплазматичне зафар­бування (ІГХК: 5-6). Середнє значення ІГХК до­рівнювало 5,9 ±0,5 (Рис.6) (Табл.).

Таким чином, в усіх групах хворих із забруднених радіонуклідами 137Cs регіонів України виявлено статистично достовірне зростання цитоплазматичної експресії убіквітину в клітинах Сертолі, сперматогенному епітелії та клітинах Лейдіга, порівняно з аналогічними спостереженнями із «чистих» регіонів України. Одночасно із цим, ядерна експресія убіквітину в клітинах Лейдіга у зазначених хворих достовірно знижувалась порівняно з аналогічними пацієнтами із «чистих» регіонів.

Необхідно зазначити, що серед найважливіших білків, які підлягають убіквітин-залежному протеолізу є регулятори клітинного циклу, компоненти різних сигнальних шляхів, мутовані білки, білки, пошкоджені посттрансляційно, від яких клітині необхідно вчасно позбавитися, тому що подальша їх активність може нашкодити клітині, виникає необхідність синтезувати нові білки, а перевантаження цитоплазми поліпептидами веде до апоптозу. Коли потреба в певному білку відпадає, в клітині починає діяти механізм, який забезпечує зупинку функціонування та деградацію саме цього білка, в якому виділяють дві основні фази: 1) ковалентне приєднання поліубіквітинового ланцюга до білка, який підлягає деградації; 2) власне деградація білка в протеасомі. Поліубіквітиновий ланцюг, що приєднується, і є сигналом, який свідчить, що цей білок підлягає деградації, яка відбувається у великому білковому комплексі - протеасомі [1].

Поряд із основною протеолітичною функ­цією, убіквітин-протеасомна система, і, зокрема, протеасоми, мають і додаткові: процесінг та рефолдінг білків [8]. Суть процесінгу полягає в тому, що шляхом часткового гідролізу зміню­ється структура білка, відкриваються його ак­тивні центри. Процес рефолдінгу в протеасомі вивчався in vitro. З’ясувалось, що при рефолдінгу протеасома може зв’язувати пошкоджені «роз­кручені» білки і заново їх «зкручувати» [9].

В проведеному нами дослідженні виявлені молекулярні особливості убіквітин-протеасомної системи, характерні для всіх форм чоловічої неплідності, які вивчалися: екскреторно-обтура­ційної, секреторної та синдрому «лише клітини Сертолі»

ВИСНОВКИ

1. При секреторній формі чоловічої неплід­ності та синдромі «лише клітини Сертолі» у хворих із «чистих» регіонів в клітинах Сертолі та інтерстиційних ендокриноцитах - клітинах Лейдіга яєчка виявлені молекулярні зміни убікві­тин-протеасомної системи, пов’язані із посилен­ням активності протеасом - цитоплазматичних органел, що відповідають за внутрішньоклітин­ний протеоліз, процесінг і рефолдінг внутріш­ньоклітинних білків. Одночасно із цим, ядерна експресія убіквітину в клітинах Лейдіга зазна­чених груп пацієнтів достовірно знижувалась, порівняно з хворими із екскреторно-обтурацій­ною формою неплідності. Зазначені особливості убіквітин-протеасомної системи є характерними для секреторної форми чоловічої неплідності та синдрому «лишеклітини Сертолі».

2. В усіх групах хворих із забруднених радіо­нуклідами 137Cs регіонів України виявлено ста­тистично достовірне зростання цитоплазматич­ної експресії убіквітину в клітинах Сертолі, спер­матогенному епітелії та клітинах Лейдіга, порів­няно з аналогічними спостереженнями із «чис­тих» регіонів України, що свідчить про підви­щений вміст пошкоджених білків в клітинах яєчка при всіх формах чоловічої неплідності у хворих із забруднених радіонуклідами регіонів. Одночасно із цим, достовірне зниження ядерної експресії убіквітину в клітинах Лейдіга, аж до повної її відсутності, у зазначених хворих, в тому числі і при екскреторно-обтураційній неплідності, порівняно з аналогічними пацієнтами із «чистих» регіонів, свідчить про порушення регуляції клітинного циклу і швидкості транскрипції та вказує на виснаження цієї частини системи внутрішньоклітинного протеолізу в інтерстиційних ендокриноцитах у всіх групах хворих - мешканців забруднених радіонуклідами регіонів України, включаючи пацієнтів з екскреторно-обтураційною неплідністю.

3. Таким чином, молекулярне дослідження убіквітин-протеолізної системи при довготривалому впливі малих доз радіонуклідів показало, що: 1) при всіх формах чоловічої неплідності найбільш глибокі порушення убіквітин-протеасомної системи мають місце в ендокринному компоненті яєчка - клітинах Лейдіга, які здійснюють основний регулюючий вплив на процес сперматогенеза; 2) довготривалий вплив малих доз радіації призводить до підвищення вмісту пошкоджених білків у більшості клітин яєчка, що може посилити ризик виникнення мутацій у хворих, які проживають у забруднених радіонуклідами регіонах.