С.В. Базалицька, А.М. Романенко, В.С. Сакало, А.В. Сакало

Процеси убiквiтинацiї в перитуморальнiй тканинi хворих на гермiногеннi пухлини яєчка

Вступ. Зростання захворюваності на герміногенні пухлини яєчка (ГПЯ), обумовлює актуальність вивчення на молекулярному рівні змін тканини яєчка, які є передраковими [1]. В останні роки було встановлено, що порушення внутрішньоклітинного убіквітин-протеасомного протеолізу відіграють важливу роль у патогенезі багатьох захворювань людини, зокрема, при спадкових хворобах, дистрофічно-дегенеративних процесах, чоловічій неплідності та канцерогенезі, оскільки система внутрішньоклітинного протеолізу задіяна в процесах розвитку та диферен-ціації клітин, процесі проліферації, реакціях клітин на стрес та пошкодження, а також у процесі неоплазії [2]. Можна передбачити, що структурні та функціональні пошкодження компонентів убіквітин-протеасомної системи можуть відігравати значну роль і в канцерогенезі тестикулярної тканини.

Мета дослідження. Визначити особливості імуногістохімічної експресії протеїну Ubiquitin в перитуморальній тканині яєчка хворих на ГПЯ, які можна охарактеризувати як перед- ракові.

Матеріали та методи дослідження. Обстежено 40 пацієнтів, яким була виконана орхіектомія в клініці онкоурології ДУ «Iнститут урології НАМН України» протягом 2009- 2012 рр. Середній вік хворих складав 27,6 року (від 17 до 59 років). Гістологічно вивчали перитуморальну тканину яєчка та пухлину. Згідно з гістологічною класифікацією герміногенних пухлин яєчка, прийнятою ВООЗ [3], семінома була виявлена у 19 пацієнтів, несеміномні пухлини - у 21 хворого, серед яких ембріональний рак (ЕР) - у 5, тератома - у 4, пухлина жовткового мішка (ПЖМ) - у 4 і пухлини змішаної будови - у 8 пацієнтів. Iмуногістохімічне (IГХ) дослідження здійсювалось з використанням стандартного аві-дин-біотинового методу, для чого біоптати фіксували у 12%-вому забуференому формаліні, заливали в парафін і виготовляли зрізи товщиною до 5 мкм. Зрізи інкубували з первинними антитілами Ubiquitin (DAKO, Glostrup, Данія) в розведенні 1:800. Розповсюдженість та інтенсивність IГХ реакції оцінювали за напівкількісним методом у балах [4] і оцінювали від 0 до 3 балів. Загальний результат IГХ реакції визначався за показниками імуногістохімічного коефіцієнта (IГХК) від 0 до 9 балів, який одержували перемножуванням оцінок розповсюдженості та інтенсивності IГХ забарвлення. Проводився статистичний аналіз отриманих результатів.

Результати та їх обговорення. Проведене морфологічне дослідження перитуморальної тканини яєчка показало, що лише в 2 спостереженнях звивисті сім’яні канальці не відрізнялись від нормальних незмінених та в 7 визначали нечисленні сім’яні канальці з ознаками збереженого пригніченого сперматогенезу, які розташовувались в оточенні сім’яних канальців із блокованим сперматогенезом. При дослідженні IГХ експресії протеїну Ubiquitin в перитуморальній тканині у хворих із збереженим і пригніченим сперматогенезом в клітинах Сертолі спостерігалось виразне ядерне зафарбування (IГХК: 7-9) в усіх дев’яти випадках (100%). Середнє значення IГХК дорівнювало 7,2±0,04. Цитоплазматична експресія протеїну Ubiquitin в клітинах Сертолі була помірною (IГХК: 4-6) в усіх випадках (100%). Середнє значення IГХК дорівнювало 5,7±0,09. Клітини сперматогенного епітелію - сперматоцити I і II порядку та сперматиди виявляли слабку (IГХК: 1-3) (2 спостереження) та помірну (IГХК: 4-6) (7 спостережень) ядерну та цитоплазматичну експресію протеїну Ubiquitin. Середнє значення IГХК дорівнювало для сперматид - 3,3±0,09 та 4,2±0,09 - відповідно; для сперматоцитів I і II порядку - 3,9±0,09 та 5,2±0,09 - відповідно. У сперматогоніях визначалась помірна (IГХК: 5-6) (2 спостереження) та виразна (IГХК: 7-8) ядерна та цитоплазматична експресія протеїну Ubiquitin. Середнє значення IГХК дорівнювало для сперматогоній - 7,4±0,09 та 7,2±0,09 - відповідно. Необхідно зазначити, що зрілі сперматозоїди характеризувались відсутністю імуногістохімічної експресії протеїну Ubiquitin (IГХК: 0) в усіх випадках (100%). У клітинах Лейдіга слабка ядерна експресія в 2-3 бали спостерігалась у всіх 9 випадках (100 %). Середнє значення IГХК дорівнювало 2,3±0,04. Цитоплазматична експресія убіквітину була помірною (IГХК: 4-6) у 9 випадках (100%) даної групи. Середнє значення IГХК дорівнювало 5,7±0,07 (табл. 1).

У групі хворих із блоком сперматогенезу на рівні сперматогоній, сперматоцитів 1 і 2 порядку чи сперматид, (всього 26 пацієнтів), у клітинах Сертолі спостерігалось виразне ядерне зафарбування (IГХК: 7-9) в усіх 26 спостереженнях (100%). Середнє значення ІГХК дорівнювало 7,8±0,07. Цитоплазматична експресія протеїну Ubiquitin в клітинах Сертолі була помірною (IГХК: 4-6) в 14 випадках (54%) та виразною (IГХК: 7-9) - у 12 випадках (46%). Середнє значення IГХК дорівнювало 6,8±0,07. Клітини сперматогенного епітелію - сперматоцити 1 і 2 порядку та сперматиди виявляли помірну ядерну та цитоплазматичну експресію протеїну Ubiquitin в усіх спостереженнях (100%) даної групи, IГХК, при цьому, становив 4-6 балів. Середнє значення IГХК в ядрі та цитоплазмі дорівнювало відповідно в сперматоцитах - 4,3±0,01 і 5,9±0,01; в сперматидах - 3,6±0,07 і 4,6±0,07. Сперматогонії виявляли виразну ядерну та цитоплазматичну експресію протеїну Ubiquitin в усіх спостереженнях (100%) даної групи, IГХК, при цьому, становив 7-9 балів. Середнє значення IГХК в ядрі та цитоплазмі до-рівнювало відповідно в сперматогоніях - 9,0±0,07 і 8,2±0,07. Атипові статеві клітини - TIN (testicular intratubular neoplasia), визначені в перитуморальній тканині у 23 хворих (60% спостережень) із блоком сперматогенезу, виявляли помірну ядерну експресію протеїну Ubiquitin у 4-6 балів у 18 спостереженнях (79%) та виразну ядерну експресію у 7-9 балів - у 5 випадках (19%) даної групи. Середнє значення IГХК в ядрі атипових статевих клітин дорівнювало 6,4±0,12. Цитоплазматична експресія протеїну Ubiquitin в атипових статевих клітинах була слабкою у 16 спостереженнях (68%) та помірною - у 7 випадках (32%) даної групи. Середнє значення IГХК в цитоплазмі атипових статевих клітин дорівнювало 3,6±0,17. У клітинах Лейдіга ядерна експресія протеїну Ubiquitin була відсутня (IГХК: 0) в 22 спостереженнях (83%), та в 4 випадках (17%) була слабкою (IГХК: 1-3). Середнє значення IГХК дорівнювало 0,2±0,01. При цьому, в 20 випадках (77%) спостерігалось помірне цитоплазматичне зафарбування (IГХК: 4-6), в інших 6 спостереженнях (23%) - мало місце виразне цитоплазматичне зафарбування (рис. 1) інтерстиційних ендокриноцитів (IГХК: 7-8). Середнє значення IГХК дорівнювало 6,9±0,15 (табл. 1).

У хворих, в перитуморальній тканині яєчка яких виявлялись «лише клітини Сертолі» (всього 5 пацієнтів), в клітинах Сертолі спостерігалось виразне ядерне та цитоплазматичне зафарбування протеїну Ubiquitin (IГХК: 7-9) в усіх спостереженнях (100%). Середнє значення IГХК дорівнювало 8,9±0,04 та 8,4±0,06, відповідно. В клітинах Лейдіга ядерна експресія убіквітину була відсутня (IГХК: 0) в 3 спостереженнях (60%), в двох випадках (40%) визначалось слабке ядерне зафарбування (IГХК: 1-2). Середнє значення - ГХК дорівнювало 0,1±0,02. При цьому, в 2 випадках (40%) спостерігалось помірне цитоплазматичне зафарбування (IГХК: 4-6) та в 3 випадках (60%) визначалась виразна цитоплазматична експресія (IГХК: 7-9). Середнє значення IГХК дорівнювало 7,8±0,18 (табл. 1).

Висновки.

1. У результаті IГХ дослідження встановлено, що в перитуморальній тестикулярній тканині в сім’яних канальцях із блоком сперматогенезу, які складають 95% спостережень, у сперматогоніях, сперматоцитах і сперматидах, а також в клітинах Сертолі відбувається посилення процесів убіквітинації, що свідчить про інтенсивні процеси протеолізу великої кількості пошкоджених внутрішньоклітинних білків у клітинах.

2. На фоні цих процесів, в 60% спостережень у канальцях із блокованим сперматогенезом з’являються атипові статеві клітини (TIN), які відрізняються від нормальних клітин сперматогенезу іншим характером експресії протеїну Ubiquitin - мають достовірно нижчі IГХ показники ядерної та цитоплазматичної експресії протеїну Ubiquitin.

3. В спостереженнях із блоком сперматогенезу, включаючи синдром «лише клітини Сертолі», в інтерстиційних ендокриноцитах - клітинах Лейдіга, які здійснюють регулюючий вплив на процеси сперматогенезу, спостерігається порушення процесів убіквітинації у вигляді посилення цитоплазматичної експресії та майже пов-ного зникнення ядерної експресії протеїну Ubiquitin.

4. Визначені особливості експресії протеїну Ubiquitin в перитуморальній тканині яєчка хворих на ГПЯ можна охарактеризувати як передракові, які свідчать про важливу роль структурних та функціональних порушень компонентів убіквітин-протеолізної системи в процесах канцерогенезу тестикулярної тканини.