Ю.О. Мицик, В.Є. Досенко, Ю.Б. Борис, П.О. Іллюк, І.Р. Максимович, Н.В. Чернова

Застосування експресії мікроРНК-15а визначеної в тканинах пухлини у якості прогностичного біомаркера нирково-клітинного раку

Вступ. Нирково-клітинний рак (НКР) складає близько 3% серед злоякісних пухлин дорослого населення. В онкоурології цей вид новоутворень посідає третє місце після раку передміхурової залози і сечового міхура. Незважаючи на широке застосування сучасних методів діагностики і лікування, захворюваність і смертність на НКР в Україні і всьому світі невпинно зростають [1, 2].

Перебіг захворювання та прогноз хворого із НКР залежить від низки факторів, серед яких згідно з Рекомендаціями Європейської Асоціації Урології (EAU) виділяють анатомічні, гістологічні, клінічні та молекулярні. До анатомічних відносять TNM класифікацію American Joint Committeeon Cancer (AJCC); до гістологічних - ступінь ядерної атипії за Furhman, гістологічний підтип НКР, наявність саркоматоїдної диференціації, мікроваскулярної інвазії, некрозу пухлини, інвазії збиральної системи нирки; до клінічних факторів належать загальний стан хворого, локальні симптоми, кахексія, анемія, рівні тромбоцитів та нейтрофілів, співвідношення кількості нейтрофілів до кількості лімфоцитів [3]. Так, коефіцієнт ризику - hazardratio (HR) хворих із НКР та стадіями T2N0M0, T3N0M0 та T4N0M0 (по відношенню до стадії T1N0M0) має значні відмінності і становить відповідно 2,71, 5,20 та 18,88. Водночас, 5-річне канцер-специфічне виживання - cancer specific survival (CSS) хворих із світлоклітинним НКР (скНКР), папілярним НКР (пНКР) та хромофобним НКР (хрНКР) також значно відрізняється і становить 71%, 91% та 88% відповідно, а HR при II, III та IV ступенях диференціації пухлини за Furhman (по відношенню I ступеня) становить відповідно 1,16, 1,97 та 2,82 [4, 5]. За останнє десятиріччя було вивчено чимало молекулярних прогностичних факторів, серед яких вуглецева ангідраза (CaIX), васкулярний ендотеліальний фактор росту (VEGF), гіпоксія-індукований фактор (HIF), клітинний маркер проліферації Ki67, гомолог фосфатази і тензину (PTEN), Е-кадгерин, протеїни p53, p21 та багато інших. Проте, нині жоден із вивчених молекулярних факторів не продемонстрував достатньої точності в прогнозуванні перебігу НКР та не є рекомендованим до застосування у клінічній практиці [3].

В останні роки увага дослідників сфокусована на визначенні експресії різноманітних генів для прогнозування перебігу НКР, серед яких обнадійливу роль відводять мікроРНК (міРНК) [6-9]. Існують дані щодо важливого значення miR-15а, яка походить з кластера хромосомної ділянки 13q14, у патогенезі НКР [12]. У зв’язку з цим нами було припущено, що ви-значення експресії miR-15а може бути викорис-тано для прогнозування виживаності хворих із даною патологією.

Мета дослідження: встановити потенціал застосування експресії мікроРНК-15а, визначеної в тканинах пухлини у якості прогностичного біомаркера НКР.

Матеріали і методи дослідження. Ретро-спективне дослідження було дозволено Етичною комісією Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького та проводилось на базі кафедри урології вказаної вище установи, клініки Обласної клінічної лікарні Львова та Відділу загальної та молекулярної патофізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України впродовж 2015-2017 рр.

При підготовці до дослідження було проаналізовано архівні історії хвороб пацієнтів із НКР, яким було проведено хірургічне лікування - парціальну чи радикальну нефректомію в період з 2008 до 2012 р., з подальшим патоморфологічним аналізом: таким чином було виокремлено 75 випадків. Подальшим критерієм ви-ключення з дослідження (для обрахування CSS) слугувала причина смерті хворого у віддаленому післяопераційному періоді не пов’язана з перебігом НКР, всього таких випадків було 11 з 75. Таким чином, кінцева кількість випадків, включених у дослідження становила 64 хворих, вони склали основну групу. Для визначення експресії міРНК-15а в тканинах пухлини з архіву було відібрано парафінові блоки зі збереженими в них зразками тканин видаленого новоутворення. Для контролю в 15 парафінових блоків було поміщено нормальну згідно з даними посмертних патоморфологічних висновків ниркову паренхіму, від спеціально підібраних хворих: в усіх випадках смерть пацієнтів наступила від гострих порушень мозкового кровообігу внаслі-док інсульту та за даними історій хвороб патології нирок у жодному випадку не спостерігалось; також хворі були підібрані за віком. Детальна характеристика груп хворих відображена у табл. 1.

У всіх випадках було здійснено визначення експресії miR-15а в тканинах пухлини (основна група) чи нормальної ниркової паренхіми (контрольна група). Для депарафінізації усіх зразків тканин та ізоляції РНК було використано набір PureLink™ FFPE RNA Isolation Kit (Applied Biosystems, США), які виконували згідно з протоколом виробника. Визначення концентрації РНК проводили із використанням спектрофотометра (NanoDrop ND1000, NanoDrop Technologies Inc, США). МікроРНК визначали методом зворотної транскрипції та полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) у реальному часі. Зворотну транскрипцію виконували, застосовуючи набір Taq Man Micro RNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, США), специфічного праймера для мікроРНК та 10 нг тотальної РНК. Кількісну ПЛР у реальному часі проводили з використанням Taq Man Micro RNA Assays (Applied Biosystems, США): U6 snRNA, ID 001973 (як ендогенний контроль), hsa-miR-15а, ID 000389 (AppliedBiosystems, США). Температурні цикли були такі: крок ініціальної денатурації 95 °С 10 хв; 50 циклів 95 °С - 15 с та 60 °С - 60 с. Рівень експресії miRNA нормалізовано до U6 snRNA і представлено в умовних одиницях (2ДCt*100, УО). Ампліфікацію проводили на «7500 FastReal-time PCR» (AppliedBiosystems, США). Отримані результати були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення «7500 FastReal-time PCR» та відображені за допомогою графіків.

Для оцінки різниці у експресії miR-15а в основній і контрольній групах застосовувався однофакторний дисперсійний аналіз. Нормальність розподілу даних проводилась з використанням тесту Шапіро-Вілка(W=0.531, p=0.001). Оскільки W-статистика була значимою (p<0,05), то гіпотеза, що розподіл даних є нормальний, була відхилена та вірогідність відмінностей визначалась за допомогою непараметричного U тесту Мана-Вітні. Статистично до-стовірним результат вважався при значенні р<0,05. Кореляційний аналіз здійснювався із використанням методу Пірсона. CSS відображали у вигляді кривих Каплана-Маєра. Для статистичної обробки отриманих даних використовувались програми SPSSv.22 та Microsoft Exel 2016.

Результати та їх обговорення. У результаті проведеного визначення експресії міРНК-15а в тканинах НКР та здорової ниркової паренхіми нами було отримано статистично до-стовірну різницю (p<0,001) між середніми значеннями даного показника в основній та контрольній групах. Детальна статистична характеристика експресії міРНК-15а в основній та контрольній групах наведена у табл. 2. При цьому, у хворих із НКР медіана експресії міРНК-15а була значно вищою, ніж у осіб без ниркової патології: 0,10±2,62 УО проти 4,84E-03± 3,11E-03 УО (рис. 1). При проведенні кореля-ційного аналізу було встановлено сильний позитивний взаємозв’язок між розміром пухлини у хворих із НКР та рівнем експресії міРНК-15а, коефіцієнт кореляції Пірсона становив 0,724. Графік кореляції розміру пухлини при НКР та експресії miR-15а у тканинах новоутвору зображено на рисунку 2. Крім цього, ми спостерігали статистично достовірну різницю (p<0,05) між середніми значеннями експресії міРНК-15 у хворих з та без поширення злоякісного процесу в реµіонарні лімфатичні вузли, при останньому варіанті рівні експресії були значно нижчими (рис. 3).

Аналіз показників експресії міРНК-15 у підгрупах хворих із скНКР, пНКР та хрНКР засвідчив відсутність між ними статистично достовірної різниці (p>0,05), оскільки значення експресії накладались (рис. 4, табл. 2). Водночас, було констатовано вищі рівні експресії міРНК-15а при вищих ступенях диференціації НКР за Furhman (табл. 2, рис. 5), статистичне порівняння даних підгруп представлене у табл. 3. Цікавим спостереженням було те, що середні значення експресії міРНК-15а в тканинах НКР при наявності некротичних змін у пухлині та при їх відсутності достовірно відрізнялись (p<0,05): некроз пухлини був асоційований зі значно вищою експресією (рис. 6).

При аналізі виживаності було встановлено, що 3-річне та 5-річне CSS хворих із НКР складали 92,19% та та 76,6% відповідно. Водночас, спостерігали відмінності у CSSхворих із різною експресією міРНК-15 в тканинах пухлини (рис. 7): у хворих із НКР та рівнем експресії Ј0,10 УО (медіана експресії) 3-річне та 5-річне CSS становили 100% та 97,0% відповідно, а середня тривалість виживання складала 59,88±0,12 місяця (95% ДІ - 59,66-60,11), у той час, коли 3-річне та 5-річне CSS у підгрупі пацієнтів із експресією міРНК-15 >0,10 УО значно відрізнялись (p<0,001) і становили 83,9% та 54,8% відповідно, середня тривалість виживання була 49,74±2,16 місяця (95% ДІ - 45,51-53,97).

Деякі дослідники спостерігали знижені рівні експресії miR-15а при таких злоякісних пухлинах, як рак передміхурової залози, меланома, гліома, рак молочної залози, назофаренгіальний рак [10, 11]. У нашій роботі ми, навпаки, констатували гіперекспресію miR-15а в групі хворих із НКР в той час, коли у здорових осіб цей показник був достовірно нижчий (р<0,001). Водночас, отримані нами дані певною мірою співвідносяться із результатами дослідження Brandenstein, згідно з якими експресія miR-15а у сечі була значно вищою у хворих із НКР, ніж у пацієнтів із доброякісними пухлинами нирок: 18,62-248 УО проти 0,35-10,86 УО відповідно, різницю у рівнях експресії при НКР отриманих в нашій і вказаній вище роботі ми пояснюємо відмінностями у методиках ізоляції та ампліфікації міРНК[12].

Висновки

1. Вперше були отримані дані щодо рівнів експресії міРНК-15а в тканинах НКР та нормальної ниркової паренхіми: у хворих із НКР даний показник був значно вищим, ніж у групі контролю (p<0,001);

2. Вищі рівні експресії міРНК-15а в тканинах НКР були асоційовані з більшим розміром пухлини, вищим ступенем ядерної атипії, наявністю некротичних змін та поширенням у реµіонарні лімфатичні вузли, що характерно для більш агресивної біологічної поведінки даного захворювання. Взаємозв’язку рівнів експресії міРНК-15а із гістологічним підтипом НКР виявлено не було;

3. 5-річне CSS хворих із НКР та рівнями експресії міРНК-15а і0,10 УО було значно меншим, ніж у хворих із експресією нижче цієї позначки (p<0,001) і становило 54,8% проти 97,0%;

4. Отримані дані свідчать про можливість застосування міРНК-15а у якості прогностичного біомаркера НКР, та про її потенційно важливе значення у перебігу цього захворювання. Необхідні подальші дослідження для більш глибокого вивчення ролі міРНК-15а в патогенезі НКР.