С.О. Борисов, К.О. Борисов

Рівень фрагментації тканинної ДНК – діагностичний та лікувальний скринінг гострого пієлонефриту і цукрового діабету в експерименті

Вступ

Сучасна концепція апоптозу (А) базується головним чином на результатах біохімічних та електронно-мікроскопічних досліджень [1, 2, 3, 4, 5]. Отримані дані свідчать про участь апоптозу в патогенезі багатьох патологічних станів [5, 6, 7]. Останнє дозволяє класифікувати А як універсальний загальнопатологічний процес ранньо-го розвитку численних захворювань та синдромів із наявністю всього комплексу клінічних проявів [6, 7, 8]. Незважаючи на різноманітність індукторів (А), особливості шляхів його внутріш-ньоклітинної сигналізації та зміни у внутрішньоклітинних мішенях сприяють розвитку де-структивних процесів у клітині і завершуються руйнуванням геномної ДНК з подальшим клітинним фагоцитозом [9, 11, 12]. Руйнування ДНК відбувається шляхом розщеплення її подвійного ланцюжка на фрагменти між нуклеосомами. Останні можливо виявити за допомогою гельелектрофорезу у вигляді дискретних смуг, що широко використовуються для ідентифікації апоптозу [10, 12, 18].

Встановлено, що (А) відбувається, як у структурно неушкоджених здорових тканинах, так і при наявності патологічного процесу, що робить адаптивну роль А цілковито очевидною [12, 19]. Наводяться дані про те, що при інфекційно-запальному процесі (Самуилов В.Д., 2010; Едранов С.С., 2012) певну роль у клітинній загибелі відіграють ферментні системи (наспаза-3 і каспаза-9), які активують процес фрагментації ДНК та призводять до незворотного розпаду ДНК на нуклеосомальні фрагменти [Самуилов В.Д., 2010; Едранов С.С., 2012; 13; 14; 15; 19]. З огляду на вищевикладене, у наш час увага дослідників привертається не лише до вивчення чинників індукціїї або інгібіції (А) та механізмів, що його регулюють, а й до пошуку сполук або їх комбінацій, здатних впливати на інтенсивність та напрямок апоптичних процесів при моделюванні різних патологічних станів. Беручи до уваги те, що ступінь фрагментації ДНК є важливим маркером ранньої стадії апоптозу при розвитку патологічних станів метою даної роботи було вивчення рівня фрагментації ядерної ДНК у клітинах периферичної крові і нирках щурів при медикаментозному впливі на перебіг гострого пієлонефриту та супутнього йому гіперглікемічному стані (прототип цукрового діабету) в умовах експерименту.

Матеріали I методи дослIдження

Експериментальні дослідження проводились на 122 щурах лінії Вістар, вагою 200-300 г у віком 8-9 міс. Експеримент був здійснений відповідно до «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах», які схвалені 3-м Національним конгресом (Київ, 2007) і відповідно до положень «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для експериментальних та інших цілей» (Страсбург, 1986).

Тварини були розподілені на 8 груп: контрольна група - норма (n=14), тварини з гострим пієлонефритом (ГП) (n=18), дві групи тварин з ГП та ЦД I типу (n=15) та II типу (n=16), дві групи тварин з ГП та ЦД I типу (n=16) та II типу (n=14) з етіотропним медикаментозним впливом (ЕМВ), дві групи тварин з ГП та ЦД I типу (n=14) та II типу (n=15) з етіо-патогенетичним медикаментозним впливом (ЕПМВ). Воду та їжу протягом всього експерименту тварини отримували ad libitum.

Прототип цукрового діабету II типу викликали шляхом інтраперітонеальної ін’єкції стрептозотоцином в 10 мM цитратному буфері (pH 4,5) дворазово в дозі 35 мг на 1 кг протягом тижня, а модель діабету I типу одноразовою дозою 55 мг на 1 кг ваги (Байрашева В.К., 2015). При моделюванні стрептозотоцинового діабету II типу тварини отримували висококалорійну жирову їжу. Загальний стан тварин оцінювали кожного дня, а рівень глюкози в плазмі крові тварин контролювали через добу протягом експерименту та реєстрували помірну гіперглікемію, появу надлишкової ваги, дисліпідемію та альбумінурію. Модель ЦД I типу характеризувалася вираженою гіперглікемією >30 ммоль/л. Інсулін вводився діабетичним тваринам з метою запобігання смертності та зниження ваги за умови тільки критичної гіперглікемії [16, 17]. Модель гострого пієлонефриту відтворювали за методикою Авер’янової Н.К., 2008. Щурам одноразово ректально вводили ізолят Escherichia coli (ступінь бактеріурії в 1 мл 107 КОЕ), отриманий з сечі пацієнта з клінічною картиною гострого пієлонефриту. На другу добу тварини підлягали холодовому стресу при температурі 0+2 °C протягом 2 годин. Експериментальна модель ГП максимально наближена до перебігу гострого пієлонефриту в клінічних умовах.

У період стабільної гіперглікемії у тварин, моделювали гострий пієлонефрит за вище наведеною методикою. Через 4 доби після початку моделювання ГП, застосовували етіотропний медикаментозний вплив (ЕМВ) та етіотропно-патогенетичний медикаментозний вплив (ЕПМВ).

При ЕМВ у групах тварин з діабетом I та II типів при ГП застосовували внутрішньом’язово антибіотик «Гепацеф» в дозі 60 мг/кг ваги тварини на добу протягом 14 днів після моделювання ГП.

При ЕПМВ у групах тварин при ГП на тлі моделі цукрового діабету I та II типу, крім внутрішньом’язового введення антибіотика «Гепацеф» у дозі 60 мг/кг ваги тварини на добу, отримували метаболізм коригуючі лікарські засоби: перорально препарат «Нуклекс» (кислота рибонуклеїнова) з розрахунку по 21 мг/кг на добу та внутрішньом’язово препарат «Армадин» (інгібітор вільнорадикальних процесів та мем-бранопротектор 2-етил-6-метил-3-гідроксі-пірідін-сукцинат) 4,5 мг/кг ваги на добу протягом 14 днів після моделювання гострого пієлонефриту.

Через 28 діб після початку моделювання цукрового діабету, потім гострого пієлонефриту, щурів виводили з експерименту в стані глибокого наркозу з попередньою анестезією тіопенталом натрію (50 мг препарату на кг ваги).

У лейкоцитах, виділених з гепаризованої крові, та в тканині нирок спектрофотометрично ви-значали рівень фрагментованої ДНК. Венозну кров відбирали у пробірки з попередньо внесеним антикоагулянтом - 1%-вий розчин гепарину об’ємом 0,05 мл.

Визначення ступеня апоптозу проводили з використанням дифеніламінового тесту. Тканину нирок гомогенізували в сахарозному середовищі виділення (0,25 М сахарози, 1 мМ ЕДТА, рН = 7,4) при температурі 0 +4 °С. Після центрифугування гомогенату супернатант з ДНК некротичних клітин відокремлювали. До осаду ядер додавали лізис-буфер (5мМ TrisHCl, 20 мМ ЕДТА, рН = 8, 0,5% TritonX-100) у співвідношенні 1:9 (об’єм:об’єм).

Кожну пробу центрифугували протягом 15 хвилин при 13 000 g для відокремлення інтакт-ного хроматину (осад) від фрагментованої ДНК (надосадова рідина). Після цього проби ресуспензували в 0,5 мл буфера (10 мМTrisHCl, 1 мМ ЕДТА, рН = 8) і вносили 0,6 мл 12%-вої трихлороцтової кислоти при пониженій температурі.

Далі проби центрифугували при 4000 g протягом 10 хв. і супернатант відокремлювали. До пробірок з осадом додавали по 0,3 мл 5%-вого розчину трихлороцтової кислоти і проводили гідроліз на водяній бані при 90 °С протягом 10 хв. Після чого проби центрифугували і відбирали депротеїнізовану надосадову рідину. Після охолодження в пробірки з надосадовою рідиною додавали дифеніламіновий реагент (100 мг дифеніламіна, 10 мл крижаної оцтової кислоти, 0,28 мл сірчаної кислоти) в об’ємному співвідношенні 1:2 і проводили інкубацію протягом 17 год. при температурі +30 °С.

Інтенсивність забарвлення розчину прямо пропорційна вмісту ДНК в пробі. Оптичну щільність розчину вимірювали при довжині хвилі 570 нм проти контролю (дифеніламіновий реагент з додаванням 5%-вого розчину три-хлороцтової кислоти).

Кількість фрагментованої ДНК розраховували у відсотках як відношення кількості екстрагованої ДНК до загальної кількості ДНК в пробі.

Статистичну обробку даних проводили за допомогою програми Statistica.

Результати та їх обговорення

Нами встановлено, що рівень фрагментованої ДНК в лейкоцитах крові та в нирках щурів з гострим пієлонефритом суттєво зростав на 65,4% та 42,0% відповідно порівняно з нормою (табл. 1). При моделюванні ГП при супутньому гіперглікемічному стані у щурів виявлено більш значне зростання рівня фрагментації ДНК відносно норми (при моделюванні ГП на тлі моделі ЦД I типу в лейкоцитах крові на 197,9% та нирках на 96,6%), а при ГП на тлі моделі ЦД II типу в лейкоцитах крові на 158,7% та нирках на 175,2%), а також по відношенню до групи тварин з ГП (при моделюванні ГП ускладненого моделлю ЦД I типу в лейкоцитах крові на 80,0% та нирках на 38,4%), а при ГП на тлі прототипу ЦД II типу в лейкоцитах крові на 56,4% та нирках на 23,4%) (табл. 2-5).

Таким чином, звертаючи увагу на отримані результати, нами встановлено, що рівень фрагментованої ДНК в лейкоцитах крові, і в тканинах нирки у тварин з ГП більш високий при супутньому ЦД I типу в порівнянні з моделлю ЦД II типу.

Застосування ЕПМВ у тварин з ГП, ускладненим моделлю супутнього цукрового діабету I і II типів, на відміну від ЕМВ (виявлена лише тенденція до зниження), викликало вірогідне зменшення рівня фрагментації ДНК у тканині нирок по відношенню до групи без МВ - при моделі ЦД I типу зниження рівня фрагментованої ДНК в лейкоцитах крові на 33,3% та в нирках на 28,1%, при моделі ЦД II типу зниження рівня фрагментованої ДНК в лейкоцитах крові на 44,8% та в нирках на 31,3%.

Порівнюючи з відповідними даними норми, слід зауважити, що у щурів з ГП при гіперглікемічному стані рівень фрагментованості ДНК був більш високим при ЕМВ, ніж при застосуванні ЕПМВ. Так, при ЕМВ рівень фрагментованої ДНК при ГП на тлі моделі ЦД I типу був підвищений в лейкоцитах крові на 163,0% і в нирках на 80,1%, а при ЦД II типу у лейкоцитах на 122,6%, і в нирках на 56,3%. Тоді як при застосуванні ЕПМВ показник фрагментованості ДНК при ГП з ЦД I типу був підвищений в лейкоцитах крові на 98,8% і в нирках на 41,4%, а при моделі ЦД II типу в лейкоцитах на 42,7%, і в нирках на 20,4%.

Слід підкреслити, що застосування ЕПМВ у тварин з ГП та супутнім прототипом ЦД відносно даних при ЕМВ виявилось ефективним, суттєво знижуючи рівень фрагментованої ДНК: при ЦД I типу в лейкоцитах крові на 24,4% і нирках на 21,5%, при ЦД II типу в лейкоцитах крові на 35,9% і нирках на 22,9% (р<0,05).

Таким чином, беручи до уваги результати наших попередніх біохімічніх [22] і морфологічних [20, 21] досліджень можна стверджувати, що розвиток експериментального гострого пієлонефриту, особливо на тлі супутнього гіперглікемічного стану супроводжується морфо-біохімічними змінами, характерними для апоптотичної форми клітинної загибелі. Підвищення рівня низькомолекулярних фрагментів ДНК свідчить про те, що апоптичні процеси в лейкоцитах крові та нирках спо-стерігались у групі тварин з ГП, а супутній ЦД обумовлював більш суттєві їх прояви, які, у свою чергу, були виражені більшою мірою при прототипі ЦД I типу, ніж при його II типі.

Застосування ЕМВ та особливо ЕПМВ сприяло розвитку нормалізації рівня фрагментації ДНК у лейкоцитах крові та тканині нирок щурів при гострому пієлонефриті із супутнім гіпер-глікемічним станом, що свідчить про ефективність етіопатогенетично орієнтованого ме-дикаментозного впливу щодо ниркових ускладнень ЦД при гострому пієлонефриті в експериментальних умовах.

Висновки

1. При експериментальному гострому пієлонефриті, встановлено суттєве підвищення рівня вмісту фрагментованої ДНК в лейкоцитах крові на 65,4%, і в нирках щурів на 42,0% відносно норми. У тварин з гострим пієлонефритом та супутньою гіперглікемією виявлено збільшення рівня фрагментованої ДНК в лейкоцитах крові (при моделі ЦД I типу на 197,9% і при моделі ЦД II типу на 158,7%) і в нирках щурів (при моделі ЦД I типу на 96,6% і при моделі ЦД II типу на 75,2%) порівняно з нормою.

2. Встановлено, що при гострому пієлонефриті супутній прототип ЦД I типу обумовлював більш виражені патохімічні зміни рівня фрагментованої ДНК, ніж при моделі ЦД II типу: в лейкоцитах крові на 80,0% при ЦД I типу і на 56,4% при супутньому ЦД II типу, в нирках на 38,4% при ЦД I типу і на 23,4% при ЦД II типу, порівнюючи з відповідними даними групи тварин з ГП.

3. Застосування етіопатогенетичного медикаментозного впливу у тварин з ГП та супутнім гіперглікемічним станом сприяло розвитку нормалізації рівня фрагментованої ДНК, знижуючи цей показник при супутньому ЦД I і II типів у нирках на 21,5% і на 22,9% відповідно, порівняно з результатом етіотропного медикаментозного впливу. Відповідні зміни рівня фрагментованої ДНК в лейкоцитах крові при ГП і супутньому ЦД I типу (зменшення на 24,4%) та II типі (зменшення на 35,9%) відносно даних при етіотропному медикаментозному впливі свідчать про більшу ефективність корекції за-значених патологічних змін стану ДНК при ГП і супутньому ЦД II типу.