А.Д. Волкогон

Дослідження ролі генетичного поліморфізму довгої некодуючої РНК HOTAIR у виникненні аденокарциноми простати

Вступ. Застосування сучасних високотехнологічних методів досліджень дозволяє стрімко збагачувати молекулярну онкологію все більшою кількістю даних про важливу роль епігенетичних регуляторних механізмів у виникненні та прогресії пухлин. Одне з ключових значень у цьому процесі, без сумніву, належить довгим некодуючим РНК (днРНК).

Уперше ідея про можливу участь днРНК у розвитку онкологічної патології передміхурової залози з’явилася після відкриття у 1999 році дослідницьким колективом Bussemakers et al. некодуючої РНК з назвою PCA3 (Prostate cancer antigen 3), показник експресії якої в тканинах раку простати (РП) був значно підвищеним [1]. Пізніше функціональний аналіз, проведений групою Ferreira et al., показав, що інактивація PCA3 за допомогою малих інтерферуючих РНК призводить до супресії росту злоякісних клітин простати та сприяє їх апоптозу [2].

Нині значнy увагу стосовно з’ясування ролі у виникненні пухлин передміхурової залози приділяють міжгенній антизмістовній днРНК HOTAIR (HOX antisense intergenic RNA). У нещодавному дослідженні колективу Zhang et al. було встановлено, що кількість транскриптів HOTAIR у клітинах РП значно збільшується у процесі прогресії пухлини і має найбільші показники при агресивному та стійкому до кастрації РП [3]. Крім цього вчені показали, що посилена експресія HOTAIR зумовлює проліферацію клітин РП, у той час як її нокдауну призводить до пригнічення процесів росту. Щодо механізму дії цієї некодуючої РНК, то, імовірніше за все, він полягає у безпосередньому зв’язуванні HOTAIR із андрогеновим рецептором (АР) з метою перешкоджання взаємодії останнього із Е3-убіквітин лігазою MDM2 (Murine Double Minute 2). Наслідком цього є стабілізація АР під час пост-трансляційної модифікації, що призводить до його активності незалежно від наявності андрогенів [4].

На сьогодні у деяких популяціях світу проведено незначну кількість досліджень стосовно з’ясування ролі поліморфних сайтів гена HOTAIR у розвитку пухлин [5-9]. Серед них одна робота присвячена пухлинам передміухрової залози. Так, вченими колективу Taheri M et al. було вивчено частоту алельних варіантів гена HOTAIR за rs12826786-, rs1899663- і rs4759314-поліморфними сайтами серед іранських пацієнтів, хворих на РП, доброякісну гіперплазію передміхурової залози (ДГПЗ) та відносно здорових осіб. До-слідники встановили, що Т-алель за rs1899663-локусом пов’язаний із розвитком ДГПЗ. Однак значущої асоціації поліморфних локусів rs12826786 і rs4759314 із виникненням зазначених патологій виявлено не було [9].

Дослідження щодо пошуку зв’язку генетичного поліморфізму HOTAIR із настанням РП в українській популяції відсутні. Це і спонукало нас до проведення власного дослідження.

Мета дослідження: вивчення ролі rs1899663-поліморфного локусу гена довгої некодуючої РНК HOTAIR у розвитку аденокарциноми передміхурової залози (АПЗ) в українській популяції.

Матеріали і методи дослідження. Для роботи було взято цільну венозну кров 184 пацієнтів із АПЗ (середній вік [±SD] 73,03± 7,56 року) та 66 осіб чоловічої статі без онкологічних захворювань в анамнезі (середній вік 76,8±9,1 року). Усі хворі перебували на лікуванні у Сумському обласному клінічному онкологічному диспансері з 2005 до 2016 року. Морфологічний діагноз АПЗ встановлювали згідно з рекомендаціями Європейської асоціації урологів (European Association of Urology Guidelines). Усі пацієнти мали II клінічну стадію раку відповідно до TNM-класифікації злоякісних пухлин.

Дослідження проводили у відповідності до положень Гельсінської декларації (1964 р., з подальшими доповненнями, включаючи версію 2000 р.) та Наказу МОЗ України № 690 від 23.09.2009 р. Протокол дослідження був затверджений Комітетом з біоетики медичного інституту Сумського державного університету. Усі учасники надали добровільну письмову інформовану згоду на участь у генетичних дослідженнях.

Венозну кров для генотипування забирали у моновети (об’єм 2,7 мл) із додаванням етилендіамінтетраацетату («Sarstedt», Німеччина). ДНК із лейкоцитів крові виділяли використовуючи набори GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (ThermoFisher Scientific, США). Для генотипування за rs1899663-сайтом гена HOTAIR був застосований метод полімеразної ланцюгової реакції з наступним аналізом довжини рестрикційних фрагментів (PCR-RFLP). Ампліфікацію ділянки гена HOTAIR, що включає локус rs1899663, проводили за допомогою прямого (5`-TGAAAGCCAGGATCATTTAACA-3`) та зворотнього (5`-GGGCTCATGGAGACATTTTAAG-3`) праймерів. Загалом суміш для ампліфікації містила 0,1 мM кожного праймера, 5 мМ DreamTaqТМ Green Buffer (10Х) (Thermo Fisher Scientific, США), 0,5 мM суміші нуклеотидів (Thermo Fisher Scientific, США), 1 ОД Taq-полі-мерази (Thermo Fisher Scientific, США), 75- 100 нг ДНК. Об’єм суміші доводили до 25 мкл деіонізованою водою. Умови проведення полімеразної ланцюгової реакції були наступними: денатурація - 94 °С (45 с), гібридизація - 59,0 °С (45 с), елонгація - 72 °С (45 с); кількість цик-лів - 33. З метою рестрикції до 6 мкл продукту ампліфікації додавали 2 мкл ендонуклеази BseG1 (ThermoFisher Scientific, США). Утворену суміш інкубували при температурі 37 °С протягом 18 годин. Якщо в rs1899663-локусі знаходився гуанін, вихідний ампліфікат, що складався з 401 пар нуклеотидів, розщеплювався рестриктазою BseG1 на два фрагменти - 76 і 325 пар нуклеотидів. У разі заміни гуаніну на тимін ампліфікат розрізався на три частини - 63, 76 та 262 пар нуклеотидів.

Сепарування продуктів рестрикції проводили у 2,5 % агарозному гелi, що містив бромистий етидiй. Горизонтальний електрофорез проводили протягом 30 хв. (10 V/см). Візуалізацію молекул ДНК після електрофорезу здійснювали із використанням трансілюмінатора «Біоком».

Математичний аналіз отриманих даних проводили із використанням програми SPSS 17.0. Розподіл rs1899663-генотипів у дослідній та контрольній групах, а також перeвiрку відповідності цих розподілів рівновазі Харді-Вайнберга здійснювали за допомогою c2-критерію. Ризик виникнення АПЗ визначали за допомогою регресійного аналізу із розрахуванням відношення шансів (OR) та 95% довірчого інтервалу (CI) для домінантної, адитивної, рецесивної та наддомінантної моделей успадкування. Значення показника Р<0,05 приймали як статистично достовірні.

Результати та їх обговорення. У таблиці 1 наведена клініко-демографічна характеристика осіб дослідної та контрольної груп. Показано, що між цими групами відсутня різниця в частоті осіб з нормальною (ІМТ<25 кг/м2) та надмірною (ІМТ і25 кг/м2) вагою (Р=0,152). При цьому кількість пацієнтів зі звичкою палити у групі з АПЗ є значущо більшою, порівняно із контролем (Р=0,009). Також слід зазначити, що показник середнього віку осіб групи контролю є достовірно вищим, ніж у хворих із раком простати (Р=0,001). Останнє є загальноприйнятим підходом та дозволяє підвищувати надійність контролю, оскільки зменшується ймовірність розвитку онкологічної патології у цих осіб в наступних періодах їх життя.

У результаті проведеного генотипування були отримані частоти розподілу алелів та генотипів за rs1899663-поліморфним локусом гена HOTAIR у пацієнтів із АПЗ (частота Т-алелю - 0,36) та в осіб групи контролю (частота Т-алелю - 0,42). Встановлено, що розподіл алелів у кожній групі окремо не відрізнявся від очікуваної за законом Харді-Вайнберга (Р>0,05).

У таблиці 2 представлено частоти різних генотипів (GG, GT і TT) за rs1899663-сайтом гена HOTAIR та результати порівняльного аналізу їх розподілу між особами груп порівняння. Встановлено, що між хворими із АПЗ та пацієнтами контрольної групи відсутня різниця в частоті генотипів за досліджуваним однонуклеотидним полі-морфізмом (Р=0,361). Порівняння частот rs1899663-генотипів окремо серед осіб із ІМТ<25 кг/м2 та ІМТ і25 кг/м2 також не дало змогу встановити статистично значущу різницю (Р=0,858 и Р=0,080, відповідно). Схожою виявилась і картина результатів розподілу генотипів за rs1899663-сайтом окремо серед осіб без та зі звичкою палити (Р=0,744 і Р=0,465, відповідно).

Результати аналізу генотипної асоціації rs1899663-поліморфізму гена HOTAIR із розвитком АПЗ за допомогою логістичної регресії представлені у таблиці 3. Зв’язок вказаного локусу із ризиком настання раку простати виявлений не був у рамках жодної моделі успадкування як до, так і після поправки на ІМТ та звичку палити (Р>0,05). Не було виявлено асоціації rs1899663-сайту із розвитком АПЗ і окремо серед осіб, які не палять (Р>0,05), які мають звичку палити (Р>0,05) та осіб із ІМТ<25 кг/м2 (Р>0,05). Проте, у пацієнтів із надмірною вагою зв’язок досліджуваного поліморфного сайту із ризиком настання раку простати був виявлений у рамках домінантної моделі успадкування. Було встановлено, що мінорний Т-алель достовірно знижує ризик розвитку АПЗ в осіб із ІМТі25 кг/м2 (ORc=0,429; 95% СІ=0,197-0,936; Р=0,034). Статистична значущість цих результатів зберігалась і після поправки на наявність звички палити (ORп=0,388; 95% СІ=0,170-0,884; Р=0,024).

Ген довгої некодуючої РНК HOTAIR складається з 12,649 пар нуклеотидів та розташований на довгому плечі 12-ї хромосоми (12q13.13). Ген містить 6 екзонів, що розділені 5 інтронами. Поліморфний сайт rs1899663 локалізований у другому інтроні. Групою Gong et al. показано, що трансверсія G на T (rs1899663) впливає на показник мінімальної вільної енергії молекули HOTAIR у її центральній ділянці, що у кінцевому рахунку призводить до зміни вторинної структури усієї РНК [10]. Разом із цим колективом Taheri et al. встановлено, що заміна G’!T (rs1899663) посилює афінність HOTAIR до деяких транскрипційних факторів. Зокрема до PPAR (Peroxisome proliferator-activated receptor), RXRA (Retinoid X receptor alpha) та HNF4 (Hepatocyte nuclear factor 4) [9]. Останні, як відомо, асоційовані із ініціацією та розвитком багатьох онкопатологій, у тому числі, і раку передміхурової залози [11, 12].

Результати нашого дослідження продемонстрували, що в загальній виборці асоціація rs1899663-сайту гена HOTAIR із ризиком виникнення АПЗ відсутня. Проте, в такий зв’язок було виявлено окремо серед пацієнтів із надмірною вагою. Так, було встановлено, що в осіб із ІМТі25 кг/м2, які є носіями мінорного Т-алелю ризик розвитку аденокарциноми простати достовірно менший, порівняно із гомозиготами за основним G-алелем.

На сьогодні у літературі існує незначна кількість робіт, присвячених дослідженню зв’язку rs1899663-поліморфізму гена довгої некодуючої РНК HOTAIR із виникненням злоякісних пухлин. Так, колективом Taheri et al. показано, що серед населення Ірану особи чоловічої статі, які є носіями мінорного Т-алелю за rs1899663-сайтом, мають вищий ризик розвитку гіпер- плазії передміхурової залози, якщо порівнювати із гомозиготами GG [9]. Щодо жінок, то Hassanzarei et al. продемонстровано, що в іранській популяції Т-алель має захисний ефект щодо виникнення раку молочної залози [5]. Схожі результати були отримані і дослідницькою групою Yan et al. для жінок Китаю [6]. Автори показали протективний ефект Т-алелю у розвитку раку молочної залози у жінок із віком настання менархе пізніше 14 років. Разом із цим, групою Weng et al. не виявлено зв’язку rs1899663-локусу із ризиком цервікальної інтраепітеліальної неоплазії серед азіатських жінок [7], а колективом Guo et al не знайдено зв’язку rs1899663-поліморфізму із розвитком раку шийки матки в китайській популяції [8].

Висновки

Встановлено,що в українській популяції однонуклеотидний поліморфізм rs1899663 гена довгої некодуючої РНК HOTAIR асоційований із розвитком раку простати в осіб із надмірною вагою тіла. Так, у пацієнтів із ІМТі25 кг/м2, які є носіями мінорного алеля rs1899663-Т, ризик настання АПЗ нижчий, ніж у гомозигот за основним алелем rs1899663-G.

Перспективи подальших досліджень полягають у вивченні ролі генетичного поліморфізму довгої некодуючої РНК HOTAIR у виникненні іншої онкоурологічної патології, зокрема у розвитку раку нирки та сечового міхура.