О.Д. Меленевський, О.М. Чайка, О.В. Третьякова
Дослідження показників про- та антиоксидантної системи в спермоплазмі при порушенні фертильності у чоловіків
Вступ
Introduction
Одним з важливих показників погіршення стану репродуктивного здоров’я населення є безплідність, від якої страждають близько 15% подружніх пар. Упродовж останніх років в Україні щорічно реєструється майже 11 тис. випадків даної патології у чоловіків [1]. Чоловіче безпліддя - це багатофакторний синдром, що включає широкий спектр порушень. Як свідчать чисельні публікації, одну з провідних ролей у чоловічій інфертильності відіграє окислювальний стрес - порушення вільнорадикального гомеостазу в еякуляті [2, 3]. Основними причинами розвитку таких станів можуть бути хронічні інтоксикації, умови життя, несприятливі професійні та екологічні фактори, супутні захворювання, несприятливий психоемоційний стан [4, 5]. У спермоплазмі існує спермальна антиоксидантна система захисту, що складається з ферментних і неферментних факторів, а також низькомолекулярних сполук, які забезпечують підтримку оптимального оксидативного балансу еякуляту. Порушення даної рівноваги може призвести до інтенсифікації окислювальних процесів та пошкодження цілісності і проникності мембран сперматозоїдів [6].
Мета дослідження: вивчення стану про- та антиоксидантних систем в спермоплазмі при порушенні фертильності у чоловіків з різними видами чоловічого безпліддя.
Матеріали I методи дослIдження
Materials and methods
Обстежено 39 чоловіків віком 24-45 років із різним ступенем порушення сперматогенезу та гормонального профілю, що мають безпліддя в шлюбі протягом 1,5-15 років. Контролем була сперма донорів віком від 28-35 років (n=8). У залежності від показників спермограми, які були отримані на першому етапі досліджень із застосуванням загальноприйнятих в клінічній практиці методів, усі чоловіки спочатку були розподілені на 2 групи: 1-ша група - з секреторним чоловічим безпліддям (N=7), 2-га група - з екскреторно-токсичним чоловічим безпліддям (N=32). Всі учасники були повністю проінформовані про мету даного дослідження і підписали форму згоди.
На другому етапі досліджували біохімічні показники оксидативного стресу (ОС) в спермо-плазмі, і за вмістом МДА пацієнти 2-ї групи додатково були розподілені на три підгрупи: 1 - рівень МДА не перевищував 19,9 мкМ/л; 2 - від 20,6-29,1 мкМ/л; 3 - вище 30,0 мкМ/л.
Спермоплазму отримували шляхом центрифугування 1-2 мл еякуляту протягом 15 хвилин при 1700 g. Ступінь розвитку ОС характеризують стан та співвідношення основних показників про- і антиоксидантних систем. Малоновий діальдегід (МДА) - один з найбільш важливих кінцевих продуктів ПОЛ - визначали з використанням тіобарбітурової кислоти [7]. Принцип визначення активності супероксиддисмутази (К.Ф.1.5.1.5-СОД) заснований на здатності ферменту інгибувати окиснення адреналіну (при проведенні аналізу використовували адреналін фірми «Sigma-Aldrich», США) в адренохром у лужному середовищі [8]. Визначення активності каталази (К.Ф.1.11.1.6-КА) полягало у здатності перекису водню утворювати з солями молібдену стійкий забарвлений комплекс [9]. Активність глутатіонпероксидази (К.Ф.1.11.1.7-ГП) визначали за швидкістю утворення окисленого глутатіону, вміст якого досліджується у зв’язаній глутатіонредуктазній реакції за ступенем окислення НАДФН [10]. Активність глутатіонредуктази (К.Ф.1.6.4.2-ГР) визначали за кількістю витраченого в ході ферментативної реакції коферменту НАДФН [10]. Для відновлення глутатіону необхідний кофермент НАДФН2, постачальником якого є фермент глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа (К.Ф.1.1.1.49-Г-6-ФДГ). Визначення активності Г-6-ФДГ проводили за вмістом відновленого НАДФН2, що утворюється при окисленні глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюканолактон [10].
Статистична обробка результатів дослідження проведена методами варіаційного аналізу з використанням непараметричної статистики. Результати отриманих досліджень представлені у вигляді розмаху мінімальних та максимальних значень (min-max), медіани (Me) та інтерквартильних інтервалів (Q25; Q75). Перевірку статистичних гіпотез проводили за допомогою критерію Уілконсона-Манна-Уітні (U) - при рівні значимості: * - при aЈ0,05; ** - при aЈ0,01; *** - при aЈ0,001. Дані оброблялися за допомогою програмного додатку Microsoft® Office Excel 2007 та програми STATISTICA 6,0 (StatSoft Inc.) згідно з рекомендаціями [11].
Результати та їх обговорення
Results and discussion
Результати та їх обговорення. Як свідчать дані, що представлені в табл. 1, рівень вмісту МДА в першій групі із діагнозом «секреторне чоловіче безпліддя» статистично достовірно відрізнявся від показників контролю - був вищий у 1,2 ра- зу (aЈ0,05). Одночасно в даній групі спостерігалася достовірна активація ключового ферменту СОД - на 132,2% (aЈ0,05), а КАТ - мала тенденцію до зниження. Дисбаланс в системі СОД/КАТ характеризувався збільшенням даного співвідношення в 1,44 разу у порівнянні із контролем, що може викликати розвиток цитотоксичних ефектів за рахунок підвищення утворення пероксиду водню. Показники стану системи глутатіону-антиоксидантного захисту (ГАОС) у пацієнтів даної групи не мали достовірних відмінностей від контрольних значень (табл. 2).
За результатамипроведених досліджень стану про- і антиоксидантних систем в спермо-плазмі пацієнти 2-ї групи із діагнозом «екскреторно-токсичне чоловіче безпліддя» були додатково розділені на три підгрупи. Достовірні відмінності від показників контролю виявилися в 1-й та 3-й підгрупах даної групи - зниження вмісту МДА на 21,2%, та підвищення на 66,1%, відповідно (aЈ0,01).
Дослідження активності ключового ферменту СОД показало, що в першій підгрупі він мав лише тенденцію до підвищення, а КАТ - до зниження, але при цьому співвідношення СОД/КАТ збільшилося у 1,33 разу у порівнянні із контролем. В 2-й та 3-й підгрупах другої групи активність та співвідношення ферментів СОД та КАТ не відрізнялися від показників контрольної групи.
Вивчення активності ферментів ГАОС виявило достовірне зростання ГП в 1-й підгрупі на 21,7 % по відношенню до контролю (aЈ0,05), а в 3-й стійку тенденцію до зниження - на 29,4% (табл. 2).
При цьому в 3-й підгрупі, на тлі достовірного зростання ПОЛ, також спостерігалося достовірне зниження ГР та Г-6-ФДГ на 37,0% та 57,3% відносно контролю (aЈ0,05), відповідно. Таким чином, в 3-й підгрупі у пацієнтів із діагнозом «екскреторно-токсичне чоловіче безпліддя» виявлено виражені ознаки розвитку оксидативного стресу.
Як додатковий інформативний критерій для оцінки вираженості оксидативного стресу нами було використано деякі коефіцієнти - редокс-потенціали. Вони розраховуються шляхом співвідношення кількості прооксидантів (МДА) до активності суми показників різних ланок антиоксидантної системи (табл. 3).
Результати, які наведені в табл. 3, свідчать, що в 1-й групі пацієнтів з діагнозом «секреторне чоловіче безпліддя» зміна редокс-потенціалу (в 1,2 разу) проявляється активацією ферментів СОД+КАТ, а стан системи антиоксидантного захисту умовно може бути охарактеризований як «активований» за рахунок ланки «СОД+КАТ» (=.) на тлі підвищення активності ПОЛ.
Інше співвідношення показників спостерігається в підгрупах у пацієнтів з екскреторно-токсичним чоловічим безпліддям. Як свідчать дані, що наведені в табл. 3, суттєві відмінності від показників контролю виявилися в першій підгрупі - достовірне зниження редокс-потенціалу за рахунок активації системи ГАОС в 1,3 разу (aЈ0,05) () і тільки тенденції до активації ланки «СОД+КАТ» (). Загалом стан системи антиоксидантного захисту в даній підгрупі може бути охарактеризований як «компенсаторно-активований» за рахунок обох ланок антиоксидантного захисту (.).
Для другої підгрупи пацієнтів даної групи не встановлено змін в співвідношенні редокс-потенціалів по відношенню до показників контролю. Найбільші відмінності від показників контролю і 2-ї підгрупи виявлено у пацієнтів, що були віднесені до третьої підгрупи за рівнем вмісту МДА в спермоплазмі - підвищення редокс-потенціалів в 2,5 (aЈ0,01) і 1,8 разу (aЈ0,05), відповідно. Отримані дані підтверд- жують розвиток оксидативного стресу у даної підгрупи пацієнтів - підвищення активності ПОЛ на тлі зниження активності всіх ланок антиоксидантної системи (ЇЇ.ЇЇ).
ВисновкИ
Conclusions
1. У пацієнтів з діагнозом «секреторне чолові-че безпліддя» стан спермальної системи про- та антиоксидантного захисту можна оцінити як «активований» із залученням переважно ланки СОД+КАТ та одночасним порушенням балансу між роботою даних ферментів.
2. Розподіл пацієнтів із діагнозом «екскреторно-токсичне чоловіче безпліддя» на три підгрупи за вмістом МДА в спермоплазмі дозволив встановити, що перша підгрупа характеризувалася «компенсаторною активацією» переважно ланки ГАОС, в другій підгрупі - показники системи про- та антирадикального захисту не мали достовірних відмінностей від контролю. Третя підгрупа характеризувалася значним підвищенням вмісту МДА, а стан системи про- та антиоксидантного захисту можна оцінити як «оксидативний стрес».
3. Оцінка показників про- та антиоксидантних систем в спермоплазмі у пацієнтів з різними видами чоловічого безпліддя дозволить проводити більш обµрунтовану корекцію патогенетичних станів, що супроводжуються розвитком оксидативного стресу.