Р.О. Данилець

Дiагностичне та прогностичне значення коефiцiєнта PCA 3 у хворих iз новоутвореннями передмiхурової залози

Вступ. Останнім часом геномний аналіз почав широко використовуватись у наукових дослідженнях для пошуку нових біомаркерів розвитку онкопатології передміхурової залози (ПЗ), оскільки їх експресія, як правило, не змінюється з віком, у порівнянні із застосуванням тради-ційного тесту з визначення кількості загального простатоспецифічного антигену (зПСА) в крові чоловіків, а тому залежить лише від патологічного стану самої ПЗ.

Нині одним із перспективних генетичних маркерів вважається ген РСА 3 (prostate cancer antigen 3), або ген простатоспецифічного ракового антигену 3, який також позначається як DD3, тобто ген диференційного прояву, який вперше був описаний Bussemarkers та співавторами [1].

Цей ген експресується лише в тканині ПЗ, причому при виникненні злоякісної неопластичної трансформації його експресія зростає в 70-100 разів. Молекулярний продукт гена РСА 3 є поліаденілованою матричною РНК, що згодом не транслюється у білок, оскільки важливою особливістю цього продукту є те, що він містить у своєму складі велику кількість термінуючих кодонів, що складаються з амінокислот урацил (У), гуанін (Г), аденін (А), та утворюють триплети УГА, УАА і УАГ на невеликій відстані від ініціюючого кодону АУГ. РСА 3 розміщений в локусі 9q21.2 дев’ятої хромосоми клітин людини, містить чотири екзони і три інтрони і обіймає загалом ділянку ДНК в хромосомі в 25 тис. пар основ [2].

Молекулярний продукт гену РСА 3 ви-значають в осаді постмасажної сечі, що містить поодинокі малігнізовані епітеліальні клітини ПЗ за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції в режимі реального часу у поєднанні зі зворотною транскрипцією. У двох когортних дослідженнях, що були проведені в Канаді та Австрії, протестовано мРНК РСА 3 щодо її потенційних можливостей як діагностичного біомаркера [3, 4]. У більш ніж 700 чоловіків було досліджено постмасажну сечу та одночасно виконана біопсія ПЗ з метою визначення існування кореляцій між концентрацією молекулярного продукту гена РСА 3 в сечі, з одного боку, та стадією онкозахворювання і його агресивністю, з іншого боку. Авторами було запропоновано спеціальний показник - коефіцієнт РСА 3, що визначався як співвідношення ідентифікованих копій м-РНК індуцибельного гена РСА 3 до присутніх копій м-РНК конститутивного гена калікреїну 3 (KLK 3). Якщо взяти до уваги, що експресія гена KLK 3 при розвитку злоякісної неопластичної трансформації ПЗ майже не змінюється, то це дає підстави використовувати коефіцієнт РСА 3 для спостереження за зміною індуцибельних властивостей гена РСА 3 і тим самим контролювати зміну його експресії в раковій тканині порівняно з тим, що спостерігається при ДГПЗ або в нормальній тканині ПЗ. До того ж, авторами встановлено існування чіткої кореляції між величиною коефіцієнта РСА 3 і ризиком виникнення раку передміхурової залози (РПЗ).

Отримані дані дали змогу стверджувати про доцільність використання коефіцієнта РСА 3 як прогностичного біомаркера РПЗ у хворих з першою негативною біопсією або ще до її виконання [5, 6]. Крім того, доведено, що коефіцієнт РСА 3 можна застосувати для визначення агресивності пухлин та вибору методу лікування, який у хворих з РПЗ проводиться або шляхом тривалого спостереження за хворим, або здійсненням радикальної простатектомії (РПЕ) [7]. З огляду на це, у проспективному дослідженні показано, що завдяки застосуванню коефіцієнта РСА 3 у хворих з підвищеним значенням сироваткового ПСА вдається суттєво зменшити загальну кількість біопсій [8]. Однак деякі причини гальмують поширення цього тесту у клініках. По-перше, достатньо висока його вартість, по-друге, не чітке визначення порогової межі для коефіцієнта РСА 3, по-третє, наявність окремих випадків, коли у агресивних пухлин визначається малий коефіцієнт РСА 3, а не високий, як це мало би бути [9].

Мета дослідження: визначити концентрацію мРНК гену PCA 3 в сечі у хворих з новоутвореннями передміхурової залози та оцінити діагностичне і прогностичне значення його коефіцієнта.

Матеріали та методи дослідження. У дослідженні брали участь 246 чоловіків віком від 49 до 79 років, які проходили планове комплексне обстеження в ДУ «Інститут урології НАМН України» у 2013-2016 рр. Від усіх хворих була отримана письмова згода на участь у дослідженні. Хворі з простатитом та наявністю урогенітальних інфекцій участі у дослідженні не брали. Усі хворі були розподілені на три групи, з яких 107 мали РПЗ, 71 - ДГПЗ, у інших 68 - ніяких ознак патології ПЗ.

У всіх хворих брали на аналіз кров з метою визначення рівня зПСА в сироватці, а також проводили пальцеве ректальне дослідження (ПРД) та трансректальне ультразвукове дослідження (ТРУЗД) ПЗ. Хворі, що мали рівень зПСА крові і4,0 нг/мл, направлялись на проведення біопсії ПЗ. Крім того, біопсію також виконували чоловікам, що потрапили до категорії з підозрою на РПЗ після ПРД та ТРУЗД [10].

Біопсію ПЗ виконували під контролем ТРУЗД з 10-18 точок за допомогою біопсійної голки G18. Патоморфологічне дослідження здійснювали відповідно до класифікації за шкалою Глісона [11]. Класифікацію злоякісних пухлин за клінічними стадіями проводили у відповідності до системи TNM (2002) [12].

Отримання постмасажної сечі від хворих здійснювали шляхом проведення пальцем по три рази уздовж латеральної лінії кожної долі зверху вниз, створюючи при цьому однаковий тиск на ПЗ у місцях дотику. Після цього хворим пропонували зібрати першу порцію сечі об’ємом 30-50 мл в пластиковий контейнер з декількома мл водного розчину ЕДТА. Надалі сечу збері-гали при 0-4 °С не більше ніж 48 год. Зразки постмасажної сечі центрифугували при 2 000 g 30 хв. Отриманий осад промивали декілька разів холодним фосфатним буфером на фізіологічному розчині за допомогою ресуспендування та подальшого центрифугування.

Екстракцію РНК зі зразків проводили за допомогою набору RNeasy (Qiаgen). Екстраговану РНК використовували для синтезу кДНК за допомогою набору для зворотної транскрипції QuantiTect (Qiаgen). Експресію PCA 3, KLK 3 та контрольно-диспетчерського гену (housekeeping gene) b-актину проводили з використанням прямих та зворотних праймерів цих генів, а також відповідних проб з флуоресцентними зондами на 52’-кінці та гасниками флуоресценції на 32’-кінці. Ген b-актину слугував для кількісного контролю РНК екстракції та кДНК синтезу. Для визначення сили експресії генів проводили кРЧ-ПЛР на приладі «RotorGene 6000». Розраховували коефіцієнт РСА 3 за формулою: РРСА3 = кількість молекулярних копій мРНКРСА3 / кількість молекулярних копій мРНКKLK3 x 103 [13].

Статистичну обробку результатів аналізу проводили непараметричними методами варіа-ційного аналізу Манна-Уітні та Крюскала-Валліса. Попарне порівняння трьох та більше груп здійснювали з урахуванням поправки Бонфероні при a=0,05. Відмінності між групами вважали статистично значимими при рЈ0,05. Довірчі інтервали середніх значень визначали за допомогою стандартної похибки при р=95%, а середні значення вибірок даних представляли у вигляді медіани [14].

Результати та їх обговорення. Результати патоморфологічного аналізу біоптатів та пухлин, вилучених у хворих на РПЗ під час операцій, представлено в табл. 1. Як свідчать дані, РПЕ було виконано загалом 56 хворим. З них лише один мав клінічну стадію сТ1 (сТ1с), 28 - сТ2 (сТ2а, сТ2b, сТ2с) та 27 - сТ3 (сТ3а, сТ3b). Диференціація пухлин за шкалою Глісона перебувала у межах 5-9 балів, що узгоджувалось з даними патоморфологічного аналізу біоптатів, хоча у одного хворого сума балів 3+5=8 після біопсії була змінена на 3+4=7. Це відбулося тому, що на біопсії превалював первинний компонент 3, а третинний компонент 5 був обраний, бо він за своїм значенням був найвищим, при цьому вторинний компонент 4 було вилучено. При проведенні аналізу всієї пухлини до загальної суми балів за шкалою Глісона було включено первинний та вторинний компоненти, які превалювали в гістологічних препаратах [11].

У 30% прооперованих хворих спостерігалось поширення пухлин у капсулу ПЗ, причому позитивні хірургічні краї було зареєстровано у 23 випадках. До того ж, у 21% хворих на РПЗ виявлено вторинне враження лімфатичних вузлів, що поєднувалось з поширенням пухлини на сім’яні пухирці та сечовий міхур.

У табл. 2 представлені кількісні дані щодо схильності хворих різного віку до утворення пухлин ПЗ. Виявлено, що у чоловіків середнього віку (45-54 років) ймовірність появи пухлин складала 0,06, причому для цієї вікової категорії присутності агресивних пухлин відмічено не було. У віковому діапазоні 55-64 років ймовірність появи пухлин підвищилась до 0,41, а вірогідність виникнення онкотрансформації агресивного генезу зросла до 0,35. Серед чоловіків 65-74 років ймовірність розвитку онкотрансформації поступово підвищується до 0,56, а при переході до вікової категорії 75-84 років досяг пікового значення в 0,87, при цьому суттєво зросла і ймовірність появи агресивних пухлин, яка у першому випадку становила 0,47, а у другому - 0,71. У той же час для всієї когорти хворих ймовірність появи онкотрансформації взагалі дорівнювала 0,43, а онкотрансформації агресивного генезу - лише 0,18.

Тут варто згадати про появу в літературі даних про те, що вірогідність виникнення онкотрансформації певним чином залежить від особливостей генотипу, наявності в геномі активованих онкогенів, про що деякою мірою можна судити на підставі расової приналежності хворих до африканських народів та підвищеної схильності до появи РПЗ серед чоловіків їхніх родин, зокрема у братів, синів або батька [16].

Аналіз коефіцієнта РСА 3 в седиментах сечі, що була отримана після пальцевого ректально- го масажу ПЗ шляхом потрійної рівномірної сили натискання зверху вниз уздовж кожної долі, показав існування статистично значущих відмінностей за цим критерієм між групою хворих на РПЗ, з одного боку, та групою умовно здорових чоловіків разом з групою хворих на ДГПЗ, з іншого боку (рис. 1). У той же час статистично значущих відмінностей між групою умовно здорових чоловіків та групою хворих на ДГПЗ встановлено не було.

Коефіцієнт РСА 3 у групі хворих на ДГПЗ змінювався в інтервалі 9-815, при цьому інтерквартильний діапазон знаходився в межах 17- 89, а значення медіани дорівнювало 56. Втім, у групі хворих на ДГПЗ коефіцієнт РСА 3 коливався в межах 0-62, мав значення медіани 12, при цьому інтерквартильний діапазон дорівнював 8 і перебував у межах 7-15. У групі умовно здорових чоловіків медіана коефіцієнта РСА 3 дорівнювала 8, інтерквартильний діапазон знаходився в межах 5-10, максимальне значення коефіцієнта РСА 3 не перевищувало 17, а мінімальне наближалося до нуля.

У той же час аналіз експресії гену РСА 3 в седиментах постмасажної сечі не виявив існування будь-яких статистичних розбіжностей за критерієм коефіцієнта РСА 3 між трьома групами, хворих на РПЗ, що мали суму балів за шкалою Глісона пухлин відповідно не більше 6, 7 і не менше 8. Так, у групі хворих, що мали диференціацію пухлини за Глісоном не менше 6 балів, величина медіани коефіцієнта РСА 3 становила 43, інтерквартильний діапазон перебував в межах 18 - 97, а всі значення коефіцієнта РСА 3 не перевищували 156 і не були меншими за 9.

Одночасно в групі хворих на РПЗ, що мали пухлини з диференціацією за Глісоном рівним 7, медіана коефіцієнта РСА 3 дорівнювала 50, інтерквартильний діапазон охоплював інтервал 23-89, а всі значення коефіцієнта РСА 3 укладались у межі 8-182. Між тим, хворі на РПЗ, з диференціацією злоякісної пухлини за шкалою Глісона не менше 8 балів, виявили значення медіани коефіцієнта РСА 3 на рівні 42, величину інтерквартильного діапазону в 58 одиниць, що охоплював інтервал від 15 до 73, при цьому всі значення коефіцієнта РСА 3 не перевищували величину 189 і не були меншими за 5 (рис. 2).

На відміну від результатів наших досліджень, Ferro зі співавторами вдалося знайти дискримінаційні властивості коефіцієнта РСА 3 щодо прогнозування агресивності злоякісних пухлин ПЗ, хоча інші дослідники цього теж не виявили [17, 18].

Пошук кореляційних залежностей між клінічною стадією РПЗ та величиною коефіцієн-та РСА 3 в седиментах постмасажної сечі теж не встановив суттєвих розбіжностей між групами хворих, які перебували на різних клінічних стадіях захворювання.

Відповідно до рис. 3, у групі хворих на стадіях сТ1с - сТ2а величина медіани коефіцієнта РСА 3 в седиментах постмасажної сечі дорівнювала 47, інтерквартильний діапазон знаходився в межах 19-79, а всі значення коефіцієнта РСА 3 укладались в інтервал 5-130. У той же час хворі зі стадіями сТ2в-с мали медіану коефіцієнта РСА 3 на рівні 53, інтерквартильні границі 21 та 84, при цьому сам коефіцієнт РСА 3 змінювався в межах 6-170. У групі хворих на РПЗ зі стадіями сТ3а-в медіана порівняно з першими двома групами дещо знижувалась до рівня 45, а інтерквартильний діапазон охоплював інтервал значень від 17 до 78, тоді як величина коефіцієн-та РСА 3 перебувала в межах 5-140.

Таким чином, проведені дослідження показали існування безсумнівних прогностичних ознак у гена РСА 3 та його транскрипційного продукту. Це дає підстави застосувати РСА 3 для діагностики РПЗ. З цього приводу деякими авторами навіть робились спроби визначити РСА 3 у крові, еякуляті, уретральних змивах та сечі, але вони були невдалими. Тому найбільш перспективним слід вважати використання постмасажної сечі, що є першою порцією сечі об’ємом в 30-50 мл, яка разом з секретом ПЗ також містить і клітини залозистого епітелію, а у разі наявності злоякісної пухлини ще і онкотрансформовані клітини, оскільки останні набувають здатність легко злущуватись з поверхні пухлини та по внутрішніх протоках ПЗ мігрувати до уретри, а звідти вже у складі постмасажної сечі потрапляють з організму назовні і можуть бути використані в аналітичних цілях. З огляду на те, що малігнізовані клітини ПЗ є джерелом посиленої транскрипції гена РСА 3, а нормалізована кількість мРНКРСА3, як показано вище, може слугувати з великою імовірністю для прогнозування появи РПЗ, то є всі підстави для подальшого більш поглибленого вивчення тих можливостей, що відкриваються у ранній діагностиці РПЗ із застосуванням саме цього біомаркера. До того ж, поєднання реакції зворотної транскрипції з полі-меразною реакцією в реальному часі не тільки надає методу високої чутливості, але й дає змогу визначати в сечі присутність до однієї ракової клітини.

У той же час при аналізі експресії РСА 3 у злущених малігнізованих клітинах залозистого епітелію ПЗ виявити прямопропорційну залежність сили експресії РСА 3 від клінічної стадії РПЗ, ступеня агресивності злоякісної пухлини та екстракапсулярного поширення пухлини не вдалось. Це, в першу чергу, може бути пов’язано з методикою отримання зразків постмасажної сечі шляхом потрійного натискання вздовж латеральної лінії кожної долі передміхурової залози. За таких умов, як правило, збільшується ймовірність відриву та злущення малігнізованих клітин з пухлин, що мають велику площу зовнішньої поверхні за рахунок великого об’єму самої пухлини або її мультифокальності. При цьому зрозуміло, що ефективність злущення та відриву клітин має досягати своєї критичної межі ще задовго до того, як пухлина поглине всю ПЗ, вийде за її межі та переміститься на інші органи або лімфатичні вузли. Варто додати, що помітне розростання пухлини, як правило, корелює з її агресивністю та появою осередків онкотрансформації з числами Глісона 4 та 5, що свідчить про поступову втрату своєї морфологічної диференціації такими пухлинами. У результаті відбувається руйнування внутрішньої анатомічної будови ПЗ, зникнення більшості мікрозалоз, порушення внутрішньої мікроциркуляції, що загалом призводить до виникнення суттєвих перешкод у надходженні секрету ПЗ до уретри. З огляду на це, поширення відокремлених малігнізованих клітин по мікроциркуляторному руслу ПЗ та їх надходження до уретри з великою імовірністю починає пригнічуватись, що спричиняє збідніння зразків постмасажної сечі малігнізованими клітинами. Внаслідок цього коефіцієнт РСА 3 замість того, щоб зростати, навпаки, зменшується.

Висновки

1. Проведене крос-секційне рандомізоване когортне дослідження виявило значне зростання (20-110 разів) вмісту мРНК РСА 3 гена в седиментах сечі у хворих на РПЗ порівняно з хворими на ДГПЗ та умовно здоровими чоловіками.

2.Встановлено прогностичні властивості та специфічність спеціального показника - коефіцієнта РСА 3 щодо диференційної діагностики злоякісних пухлин ПЗ. Сам показник показує силу експресії гену РСА 3, нормалізовану по гену KLK 3 в малігнізованих епітеліальних клітинах ПЗ, що потрапили у постмасажну сечу.

3.Показано, що коефіцієнт РСА 3 не є адекватним показником для діагностики клінічної стадії РПЗ, агресивності злоякісних пухлин та ДГПЗ у чоловіків.