Р.В. Савчук

Активність лактатдегідрогенази в артифіційному сечовому міхурі (експериментальне дослідження)

Інвазивний рак сечового міхура (см) - захворювання, що є причиною найбільшої смертності серед злоякісних новоутворень в урології [1]. Так, в Україні смертність від раку СМ в 2016 р. становила 4,6 випадку на 100 тис. населення [2].

Основним методом лікування інвазивного раку СМ є радикальна цистектомія - оперативне втручання, що полягає у видаленні сечового міхура і пов’язане з великою кількістю ускладнень раннього і пізнього післяопераційного періоду. Крім онкологічних результатів, сьогодні важливим після видалення СМ є вибір типу відведення сечі у різних пацієнтів. Аспекти, розглянуті при сучасній деривації сечі, включали сегмент використовуваного шлунково-кишкового тракту, анатомічне розташування можливої стоми, збереження уретри для ортотопічної деривації, питання про збереження верхніх відділів сечових шляхів і гендерні розбіжності [3].

Найкращим матеріалом для формування ортотопічного СМ, визнаним в усьому світі, є сегмент термінального відділу клубової кишки (ileum) [4-6]. Дев’яностоденна післяопераційна смертність при вивченні результатів проведення радикальної цистектомії в Канаді та Великобританії коливається від 5,1 до 8,1% [7, 8], що є високим показником для операції з намірами зцілення. Також відзначена висока частота післяопераційних ускладнень (28-64%) протягом 90 днів навіть у центрах з великим обсягом і досвідом таких оперативних втручань [9, 10].

Вивчення змін структурно-функціонального характеру в стінці артифіційного СМ триває протягом останніх двадцяти років. За даними дослідників, результати є досить суперечливими: так, деякі вчені відзначають гіперсекрецію сульфомуцинів, сіаломуцинів, прогресуючу атрофію мікроворсинок, аденоматозну гіперплазію і дисплазію [11, 12].

Припускають, що вплив сечі та виконання нових функцій, не властивих ілеум, спричинюють структурно-функціональні й ферментативні зміни в стінці необладера зі зміною активності ферментів окисно-відновних реакцій у тканинах артифіційного СМ, які залишаються поза увагою дослідників, хоча їхня діяльність зумовлює перебіг основних процесів життєдіяльності в тканинах організму.

Мета дослідження: вивчити особливості гістохімічно виявленої активності лактатдегідрогенази в стінці артифіційного сечового міхура в експериментальних тварин.

Матеріали та методи дослідження. Матеріалом цього дослідження послужили результати, отримані при дослідженні 18 самиць mini-pigs віком 4-5 міс. і масою 8-10 кг. В експериментальних тварин моделювання артифіційного сечового міхура виконували шляхом цистектомії з наступною ілеоцистопластикою.

Вибір експериментального об’єкту зумовлений анатомічними міркуваннями: у самиці уретра є прямою і в 5-7 разів коротшою порівняно з самцями.

Методика оперативного втручання була такою. Під внутрішньовенним наркозом (тіопентал) у положенні на спині свині виконують розріз черевної стінки по середній лінії від лобкового симфізу до пупка. Верхівку сечового міхура захоплюють щипцями, підтягують догори та видаляють. Гемостаз. Відступаючи 15 см від ілеоцекального клапана, ушивають кінець ізольованого кишкового сегмента безперервними серозно-м’язовими швами вікрил 4-0. Уздовж протибрижового краю розсікають дистальну частину клубово-кишкового сегмента довжиною приблизно 10 см. Розсічену частину сегмента

U-подібно укладають, суміжні краї обох колін зшивають одним рядом безперервних серозно-м’язових швів вікрил 4-0. Нижню частину отриманого U-подібного сегмента укладають поперечно догори. Перед зшиванням вільних країв розсіченого сегмента в приносне коліно клубової кишки встановлюють сечовідні катетери № 3Fr, кінці яких виводять через стінку резервуара. У найбільш каудальній частині резервуара роблять отвір, до якого підшивають уретру шістьома швами вікрил 4-0. Шви зав’язують після проведення через уретру катетера № 8Fr. Резервуар дренують цистостомічною трубкою 12Fr, яку виводять разом із сечовідними стентами через стінку резервуара. Резервуар укладають на місце, формують ізоперистальтичне приносне коліно. Клубову кишку розсікають на рівні пересічених попередньо сечоводів - на 10 см вище клубово-кишкового резервуара. Сечо-води косо зрізають, розсікають уздовж і анастомозують кінець у бік з проксимальною нерозсіченою частиною клубово-кишкового сегмента. Стенти, розташовані всередині сегмента, проводять у сечоводи. Відновлюють безперервність кишки. Стенти виводять через передню черевну стінку, в малий таз встановлюють дренажі через контрапертури. Рану ушивають вікрилом.

При проведенні оперативного моделювання сечового міхура вилучали фрагмент стінки клубової кишки і стінки СМ. Отриманий матеріал поміщали на суху вуглекислоту (-70 °С) для миттєвого заморожування. З отриманих блоків виготовляли кріостатні зрізи завтовшки 11 мкм, на яких за прописами Ллойда проводили гістоензиматичні реакції з виявлення активності лактатдегідрогенази (ЛДГ). Результати, отримані при дослідженні активності ферменту в стінці клубової кишки (ілеум) і сечового міхура, виді-лених до початку створення моделі СМ, надалі використовували як контроль. Експериментальних тварин з моделлю СМ групами по 6 особин виводили з досвіду через 3, 6 і 12 міс. після оперативного моделювання. Виведення з досвіду здійснювалося методом передозування тіопенталу натрію. У тварин вилучали фрагмент стінки клубової кишки (ілеум) і штучного СМ. Отриманий матеріал обробляли відповідно до вищеописаного алгоритму. На отриманих кріостатних препаратах визначали активність ЛДГ. Вищезгаданий фермент був обраний для дослідження у зв’язку з тим, що лактатдегідрогеназа (1.1.1.27, ЛДГ) - фермент останнього етапу гліколізу з відновленням, в анаеробних умовах, пірувату в лактат із вивільненням НАД+. Оцінка результатів гістохімічних досліджень здійснювалася напівкількісним методом (Насибуллин, 1992), що розроблений і базується на кореляції бальної оцінки активності ферментів і даних цистоспектрофотометрії (вимірюється в умовних одиницях оптичної щільності - ум. од.) Результати досліджень піддавалися стандартній статистичній обробці.

Результати та їх обговорення. Активність ЛДГ в інтактному клубовому кишечнику представлена в табл. 1. У клітинах епітеліоцитів активність ЛДГ висока - (6,03±0,23) ум. од. - або близька до неї, отже, можна говорити про інтенсивне утворення пірувату, що робить можливим оптимальне субстратне забезпечення діяльності циклу Кребса.

Водночас активність ЛДГ у підслизовій пластині - (5,010±0,144) ум. од. - і у м’язовому шарі - (6,020±0,124) ум. од. - помірна, отже, можна вважати, що потреба циклу Кребса в цих структурах забезпечується не лише за рахунок розщеплення глюкози, але й за рахунок окиснення додаткових субстратів.

Визначення активності ЛДГ через 3 міс. після виконання ортотопічної ілеоцистопластики показало її зниження на 38,1% - (3,10±0,09) ум. од. (р<0,05) - у підслизовому шарі, дана тенденція спостерігається і через 12 міс. експерименту. Ці зміни дозволяють вважати, що в клітинних елементах підслизової у субстратному забезпеченні більшу роль починає відігравати надходження субстратів із проміжних метаболітів - альфа- кетоглутарат. Статистично достовірних розбіж- ностей в епітелії ілеум mini-pigs на різних ета- пах експерименту ми не виявили. Привертає увагу зниження на 15,6% - (5,08±0,19) ум. од. (р<0,05) - активності ЛДГ у м’язовому шарі ілеум в експериментальних тварин порівняно з первинними показниками.

У нативному СМ mini-pigs відзначена низька активність ЛДГ в епітеліоцитах і підслизовому шарі, що становило (3,00±0,12) і (3,00± 0,21) ум. од. відповідно. У м’язовому шарі детрузора визначалася висока активність ЛДГ - (6,00±0,14) ум. од.

Формування артифіційного сечового міхура, виконання нової функції й контакт із сечею позначилися на пригніченні активності ЛДГ у структурних елементах стінки неоциста (рис. 1).

Через 3 міс. після початку експерименту активність ЛДГ в епітеліоцитах необладера зни-жується на 33% - 4,06±0,10 ум. од. (р<0,05) - порівняно з контрольними показниками ілеум, але до 6-го і 12-го місяця експерименту показники приходять у відповідність з нативними даними.

Дані, отримані при вивченні активності ЛДГ у підслизовому шарі, представлені на рис. 2.

При порівнянні активності ЛДГ в інтактному підслизовому шарі сечового міхура - 3,00±0,21 ум. од. - та ілеум - 5,010±0,144 ум. од. (р<0,05) - привертає увагу підвищена активність у клубовій кишці на 40,12%.

Через 3 міс. після початку експерименту виявлена відсутність достовірних розбіжностей активності ЛДГ у підслизовому шарі артифі-ційного сечового міхура - 5,04±0,2 ум. од. - від ілеум інтактних тварин. У свою чергу, через 6 міс. відзначено зниження на 19,2% - 4,07±0,09 ум. од. (р<0,05), а через 12 міс. зниження на 59,3% - 2,01±0,09 ум. од. (р<0,05). Ці зміни дозволяють вважати, що в клітинних елементах підслизової у субстратному забезпеченні значну роль починає відігравати надходження субстратів із проміжних метаболітів - альфа-кетоглутарат.

Дані, отримані при вивченні активності ЛДГ у м’язовому шарі, представлені на рис. 3.

Привертає увагу відсутність достовірних розбіжностей між активністю дегідрогенази в сечовому міхурі - 6,00±0,14 ум. од. та ілеум - 6,020±0,124 ум. од. При дослідженні активності ЛДГ у м’язовому шарі артифіційного сечового міхура відзначено її зниження на 33% - 4,03±0,09 ум. од. (р<0,05) через 3 міс., така тенденція зберігалася до кінця експерименту.

Можна вважати, що гіпертрофія міоцитів змінює транспортні можливості судинної системи артифіційного сечового міхура, що, з одного боку, зумовлює зсув акценту субстратного забезпечення у бік проміжних метаболітів, а недостатнє загальне постачання сприяє збереженню процесів життєзабезпечення на відносно невисокому рівні.

Висновок

Таким чином, за даними нашого дослідження, активність ЛДГ у структурних елементах ілеум і артифіційного сечового міхура зазнає значних змін. У клубовому кишечнику статистично достовірне зниження активності ЛДГ відзначено лише в підслизовому шарі (на 38,1%) і зберігається до закінчення експерименту. Можна вважати, що завершення післяопераційного періоду повертає функціональну активність структур кишкової стінки у вихідний стан, що зумовлює нормалізацію активності ферментів циклу Кребса, а також ферментів циклів субстратного забезпечення основного циклу енергозабезпечення життєдіяльності.

Формування артифіційного СМ з ділянки ілеум, виконання нової функції й контакт із сечею спричинили зниження активності ЛДГ практично у всіх структурах необладера. Хотілося б відзначити пригнічення активності ЛДГ на 59,3% у підслизовому шарі на 12-му місяці експерименту.

Отримані результати ще раз доводять пригнічення енергетичного обміну на різних стадіях, потенційну гіпоксію в тканині, що зумовлено новими функціональними обов’язками трансплантата, і потребують подальшого вивчення.