Ф.I. Костєв, Л.I. Красилюк, Р.В. Бахчієв, Д.О. Кузнєцов, О.В. Руденко

ПІН - передрак передміхурової залози, патогенетичне обґрунтування моніторингу хворих

Вступ. Останнім часом дослідники приділяють значну увагу визначенню особливостей розвитку передракових станів і ранніх стадій канцерогенезу раку передміхурової залози (1, 11, 3). Серед патологічних варіантів зміни епітелію передміхурової залози, які розглядаються як пренеопластичний процес, виділяють проліферативну запальну атрофію (РІА) і простатичну інтраепітеліальну неоплазію (ПІН) (10, 5).

Частота ПІН та її зв’язок із РПЗ, особливо ПІН високого ступеня, викликають деякі питання щодо діагностики й тактики спостереження хворих. Враховуючи, що можливість трансформації ПІН у карциному in situ або інвазивний рак оцінюється як тривалий період (22), потрібна розробка методів раннього виявлення та превенції, що може знизити кількість випадків РПЗ (24), або відстрочити виникнення захворювання в осіб з високим ризиком розвитку РПЗ (9). Тому розробка методів діагностики ПІН передміхурової залози та її клінічного перебігу є актуальним завданням урології.

Через відсутність досконалих скринінг-програм із раннього виявлення РПЗ у багатьох чоловіків захворювання приймає невиліковну метастатичну форму. Успіх та результативність лікування прямо пропорційно залежать від своєчасного проведеного комплексу діагностичних процедур. Єдиним та ефективним способом зниження захворюваності та смертності від РПЗ залишаються рання діагностика та своєчасне раннє лікування (12, 4). Внаслідок відсутності патологічних симптомів на ранніх стадіях РПЗ, діагностика є однією з найскладніших проблем сучасної онкоурології. Велика питома вага поєднання РПЗ з доброякісною гіперплазією передміхурової залози та хронічним простатитом знижує чутливість, специфічність та точність широко вживаного лабораторного показника, такого як сироватковий простатичний специфічний антиген (ПСА), пальцевого ректального дослідження та трансректального ультразвукового дослідження (23, 15, 19).

У 1999 році вперше описали (16) явище проліферації епітелію в осередках атрофії передміхурової залози і, що особливо важливо, зв’язали його із запаленням, тоді і був запропонований новий термін «проліферативна запальна атрофія (ПЗА)». Даний варіант атрофії ними описаний як такий, що локалізується переважно в периферичних зонах залози, пов’язаний з дрібними протоками, ацинусами, не носить дифузного характеру і не пов’язаний зі стимуляцією андрогенами. Реактивні вільні радикали, як первинні низькомолекулярні медіатори імунної системи, здатні прямо або опосередковано реагувати із ДНК епітеліальних і стромальних клітин і ви-кликати генетичні мутації (25), епігенетичні порушення її молекулярної структури (18) та порушувати структуру та функціональну активність білків, зокрема найважливішого пухлино-супресорного білка p53 (19). Процес окислення ліпідів, викликаний вільною дією радикалів, впливає на синтез простагландинів - найважливіших прозапальних медіаторних молекул (6), відіграє важливу роль у канцерогенезі взагалі і перед-міхурової залози зокрема (18) особливо на ранніх стадіях - гіперплазії простатичних клітин.

Можливості сучасної науки в галузі молекулярної біології дозволили визначити низку пов’язаних з РПЗ генетичних порушень (2, 8, 14).

Процес метилування, як епігенетична модифікація ДНК, у разі порушення може призводити до генетичних змін, роблячи очевидним взаємозв’язок між генетичним та епігенетичними процесами при виникненні та розвитку пухлини. З медичної точки зору це відкриває можливість для ранньої діагностики та лікування (7, 21). Виявлення мікрофункціонального стану й ультраструктурних механізмів перебігу до пухлинних процесів у передміхуровій залозі в клінічних умовах неможливо, тому нами розроблено експериментальну модель ПІН і відтворені патогенетичні механізми її розвитку та проведено спробу її експериментального лікування.

Мета дослідження: експериментальне обµрунтування патогенезу ПІН та визначення принципової стратегії в спостереженні хворих на ПІН при доброякісній гіперплазії передміхурової залози.

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні методи дослідження проведені на 159 щурах-самцях лінії Вістар тримісячного віку, масою 150±20 г, які утримувалися в стандартних умовах у лабораторії біологічної клініки Одеського національного медичного університету.

Підготовка тварин, усі інвазивні втручання, знеболювання та виведення з досліду здійснювались у повній відповідності до вимог до правил GLP, що передбачені Європейською комісією з нагляду за проведенням лабораторних та інших досліджень. Експериментальна модель ПІН є оригінальною, розроблена нами та захищена патентом на винахід (Бюл. № 20 від 27.10.2008) і полягає у попереміжному підшкірному введенні гормональних препаратів синестролу та тестостерону пропіонату. Синестрол вводили по 40 мг/кг на тиждень, протягом першого, другого, третього та шостого місяців від початку експерименту. Тестостерону пропіонат вводили по 150 мг/кг протягом четвертого, п’ятого, сьомого та восьмого місяців.

Формування ПІН підтверджено морфологічними дослідженнями тканини передміхурової залози експериментальних тварин. У групах тварин було досліджено концентрацію продуктів ліпопероксидації (малоновий діальдегід, дієнові кон’югати), активність ферментів антиоксидант-ного захисту (супероксиддисмутаза, каталаза) в крові та тканинах передміхурової залози.

Групі тварин для виявлення можливостей запобіжного заходу в розвитку ПІН вводили внутрішньом’язово фітоестроген - ЕКСО з розрахунку 0,2 мг/кг щодня протягом 8 місяців. Для вивчення частоти ПІН при доброякісних процесах у передміхуровій залозі проводили гістологічні дослідження тканини передміхурової залози у 70 хворих на ДГПЗ (середній вік 70,3±2,7 року).

Роль генетичного моніторингу в диференціюванні ПІН при доброякісній гіперплазії передміхурової залози виявлена на основі аналі-зу рівнів метилування промоторної області генів APC, GSTP1, RARІ, що дало змогу оцінити роль ПІН як передраку передміхурової залози та скерувати методику спостереження хворих. Метилування промоторної області генів проведено на тканинних зразках передміхурової залози, отриманих від 76 хворих. Ці дані обробляли із застосуванням методів варіаційної статистики з обчислюванням критерію Стьюдента.

Результати та їх обговорення. Для досягнення мети дослідження по обµрунтуванню патогенезу ПІН та розробки принципової стратегії по спостереженню за хворими з ПІН при ДГПЗ нами створена експериментальна модель ПІН на щурах. Підтвердженням адекватності авторської методики експериментальної ПІН послужили морфологічні дослідження, що проводилися поетапно зі щомісячним виведенням тварин з експерименту й суттєвістю змін з боку передміхурової залози.

Результатами морфологічних досліджень встановлено чотири основних періоди структурних зрушень. Перший - перші три місяці введення синестролу по 40 мг/кг на тиждень, при яких зберігалось збільшення розміру самих простатичних залоз; секреторний епітелій оцінювався як високий циліндричний, зі збільшеною кількістю сплющених та округлих клітин, що утворювали нашарування епітеліоцитів у два - три шари, з яких розпочато формування папілом, що мали вигляд «подушечок» та грибоподібних сосочків та відповідали початку періоду формування ПІН низького ступеня (рис. 1). Другий період протягом введення тестостерону по 150 мг/кг на тиждень характеризував морфологічну картину сформованої ПІН низького ступеня, початок появлення ділянок епітелію, формування ПІН високого ступеня, морфологічна картина характеризувалась значною кількістю справжніх сосочків, в окремих ділянках спостері-галась картина їх злиття та формування зало-зистої гіперплазії, зростала кількість «грибопо-дібних» папілом і «подушечок» з високим цилін-дричним епітелієм та забарвленою базофільно цитоплазмою. Визначався слабо виражений полі-морфізм ядер зі збільшенням деяких з них удвічі. Ядерця - дрібні, поодинокі, а хроматин - дрібнодисперсний (рис. 2).

Третій період морфологічних змін спостерігався у щурів після 7-місячного періоду введення гормонів. Усі залози містили лише незначну кількість справжніх сосочків, переважна більшість сосочків представлена утворами у вигляді «грибоподібних» папілом та «подушечок», що мали 3-4 ряди клітин (рис. 3).

Міоепітеліальні клітини розміщувалися в один шар, містили паличкоподібні ядра, які розташувалися паралельно до базальної мембрани. Указані зміни тканини передміхурової залози містять ознаки ПІН низького та високого ступенів.

Четвертий період морфологічних змін спостерігався у тварин після 8-місячного попере-мінного введення гормонів: синестролу та тесто-стерону пропіонату. Морфологічно відзначалась нерівномірна кількість справжніх і несправжніх сосочків, з переважанням несправжніх. Несправжні сосочки складалися з гіперплазованого циліндричного епітелію з розташуванням ядер на різних рівнях у 5-6 рядів, утворюючи «грибоподібні» папіломи та «подушечки» (рис. 4). Ядра помірно гіперплазовані, овальні, розміщені перпендикулярно до базальної мембрани, в окремих клітинах ядра збільшені за розміром у 2-3 рази, ядерця еозинофільні, відмічається виражений поліморфізм форми ядер. У окремих залоз з вакуолями поблизу апікального краю клітин міоепітелію, що розміщувалися в один ряд, містилися паличкоподібні ядра, які розташовані паралельно до базальної мембрани.

Розвиток експериментальної ПІН супроводжувався дезінтеграцією метаболічного стану на органному (передміхурова залоза) та організ-менному рівнях у цілому. Спостерігалось по- ступове посилення процесів ліпопероксидації, зміщення рівноваги у процесах перекисного окислення ліпідів - порушення антиоксидантного захисту, що підвищують зниження ферментів ланки антиоксидантного захисту. Так, вміст дієнових кон’югатів у передміхуровій залозі та сироватці крові після місячного курсу введення синестролу був вищим за показники контролю на 38,5%; 37,5% відповідно, а рівень манолового діальдегіду перевищував контрольні показники на 38,8% та 21,1% (табл. 1).

Активність супероксиддисмутази при цьому в передміхуровій залозі та сироватці крові достовірно посилювалась і переважали значення контролю на 40,6%; 41,5% при цьому показник активності каталази у передміхуровій залозі і еритроцитах крові був вищим за контрольні показники на 52,1% і 55,6% відповідно. Коефіцієнт співвідношення СОД|ДК показали його співвідношення до тканини передміхурової залози 18,2, а для сироватки крові - 17,0. Зазначені факти свідчать про зсув рівноваги ПОЛ - АОС праворуч за рахунок більш інтенсивного посилення активності супероксиддисмутази. Подальші введення гормональних препаратів для формування ПІН від низького до високого ступенів підсилювали цю залежність, негативно віддзеркалюючись на макроорганізменному рівні. Після 8-місячного введення синестролу та тестостерону пропіонату для формування ПІН коефіцієнт співвідношення СОД/ДК у тканинах передміхурової залози дорівнював 1,0, а в сироватці крові - 0,7.

Стан активності СОД і каталази в тканині передміхурової залози та сироватці крові і еритроцитах щурів, за умов експериментальної ПІН, представлено в табл. 2.

Таким чином, наведені факти свідчать про глибокі порушення в системі ПОЛ/АОС як на органному (передміхурова залоза), так і на організ-менному рівні (сироватка крові, еритроцити).

Вираженість змін та їх напрямок залежать від терміну формування ПІН (низький та високий ступені ПІН) і введення гормонів.

Результати біохімічних досліджень підтверджують та відповідають тим основним змінам у структурі передміхурової залози, що зберігаються в кожному з чотирьох періодів морфологічних змін на шляху формування ПІН.

Пошук фармакологічних засобів з метою корекції метаболічних змін за умов неоплазії різного походження є важливим завданням онкоурології.

Враховуючи умови моделювання ПІН з поперемінним введенням синестролу та тесто-стерону пропіонату, нами в експериментальному лікуванні ПІН запроваджено рослинного походження харчову добавку ЕКСО - ізофлованоїд сої. Кафедра урології та нефрології є учасником дослідження ефективності даного лікарського засобу в клінічному застосуванні у жінок в період клімактерію при розладах сечовипускання. Деякі наші дослідження підтвердили його антиоксидантну дію, пов’язану з посиленням активності антиоксидантних ферментів, інгібуючу дію на ангіогенез, що розцінюється як перспективний шлях до цитотоксичної терапії онкологічних захворювань нетоксичним рослинним засобом, що є фітоестрогенним, має дозвіл на застосування в клінічній практиці, розроблений «НПО Одеська біотехнологія» ТУ У013903778-66-98 від 30.07.1998 року, термін дії продовжено до 31.12.2018 року.

Нами вивчено вплив ЕКСО на ПОЛ у крові та передміхуровій залозі і стан антиоксидантного захисту.

Проведені також морфологічні дослідження впливу ЕКСО в якості запобіжної дії до утворення ПІН та вплив захисту на перебіг вже сформованої ПІН для подальшого обµрунтування патогенетичного лікування ПІН як передраку передміхурової залози, що моделюється в експерименті (табл. 3).

Використання ЕКСО сприяло зниженню вмісту ДК у тканині передміхурової залози і сироватці крові на 98,5%; 97,4% відповідно; статично достовірно знижувався МДА на 32,2% і 21,5% відповідно, що по відношенню до контролю дорівнювало 102,3%; 105,8%.

Активність супероксиддисмутази та каталази в передміхуровій залозі під впливом корекції ЕКСО також відновлювалась до показників одновікового контролю, активність каталази - до фізіологічного рівня також (табл. 4).

Коефіцієнт співвідношення СОД/ДК у передміхуровій тканині у даної групи тварин дорівнював 13,2, а в сироватці крові 12,9, що відповідає фізіологічним показникам.

Наведені факти свідчать, що використання фітоестрогену ЕКСО протягом чотирьох місяців призначення значною мірою ослаблює формування ПІН, а тривале використання засобу (8 міс.) здатне гальмувати розвиток інволютивних змін в організмі, зокрема формування ПІН в передміхуровій залозі. Використання ЕКСО на тлі поперемінного введення синестролу та тестостерону пропіонату запобігало розвитку експериментальної ПІН (рис. 5).

Згідно з результатами обстеження 70 хворих на ДГПЗ, об’єм передміхурової залози становив від 25,1 до 145,0 см3 (у середньому 81,5± 9,2). Показники загального ПСА перебували в межах від 0,9 до 10,5 нг/мл (у середньому 3,20± 1,93) вільного ПСА від 0,41 до 3,15 нг/мл (у середньому 1,24±0,17). ПІН була виявлена у 24 (34,3%) хворих на ДГПЗ, з яких у 6 (8,6%) - ПІН високого ступеня, а у 18 (25,7%) - ПІН низького ступеня.

Мікроскопією препаратів із передміхурової залози встановлені в переважній більшості варіанти аденомофіброзної гіперплазії.

Молекулярно-генетичні властивості такого передракового стану як ПІН вивчені нами у 76 хворих ДГПЗ.

Середній вік хворих склав 68,4 року (49;84), медіана рівня ПСА - 11,4 нг/мл (0,6; 88,8), середній об’єм передміхурової залози склав 75± 33,2 мл.

Предметом дослідження було метилування промоторної області генів супресорів пухлинного росту GSTP1, APC і RARІ.

Дослідження зразків доброякісної гіпер-плазії, представленої аденоматозно-стромальною формою, виявило більш високу частоту метилювання і його рівня у хворих після МФБ простати. Це пояснюється тим, що більша частина біоптатів (75,6%) представлена периферичною зоною залози. У свою чергу 87,5% цих зразків містять ПІН та атипову дрібноацинарну проліферацію. Для біоптатів ДГПЗ в поєднанні з ПІН та атиповою дрібноацинарною проліферацією характерний більш високий рівень метилювання промоторної області на відміну від рівня ПСА (табл. 5).

Зразки ДГПЗ, що містять ПІН та атипову дрібноацинарну проліферацію, відрізняються більш високим рівнем метилювання в порівнянні зі зразками ДГПЗ без таких.

Беручи до уваги, що метилювання характерно для пухлинного процесу, можна зробити висновок, що за комплексом молекулярно-генетичних ознак ПІН та атипова дрібноацинарна проліферація відрізняються від типової ДГПЗ і мають молекулярно-генетичні ознаки злоякісної пухлини.

Висновки

1. Простатична інтраепітеліальна неоплазія виявлена у 34,3% хворих на доброякісну гіперплазію передміхурової залози; у тканинах передміхурової залози переважав аденомофіброзний варіант гіперплазії.

2. Молекулярно-генетичні ознаки ПІН та атипової дрібноацинарної проліферації відрізняються від типової доброякісної гіперплазії і мають молекулярно-генетичні ознаки злоякісного процесу.

3. Патогенез простатичної інтраепітеліальної неоплазії, що обµрунтований морфологічно, оцінкою метаболізму ферментів прооксидантного впливу та антиоксидантного захисту, станом метилювання промоторної області генів GSTP1, APC і RARІ указує, що ПІН є передраком, який має молекулярно-генетичні ознаки злоякісної пухлини та потребує активного спостереження і лікування.