О.Г. Резніков, О.А. Салівоник, О.В. Сачинська, Л.В. Чайковська, Л.I. Полякова, В.М. Григоренко, О.В. Усатенко

Дослідження впливу різних доз наночастинок золота на ксенографти раку передміхурової залози

Вступ. Рак передміхурової залози (ПЗ) є гормонозалежним злоякісним захворюванням, яке в багатьох випадках ефективно лікується засобами андрогенної депривації. Разом з тим відбуваються пошуки інших препаратів для терапії цієї патології, які здатні селективно впливати на пухлину. Такі нові можливості в онкології відкривають нанотехнології і особливо - нанофармакологія [1, 2].

Наноструктури починають відігравати значну роль у молекулярній біології, медицині, фармакології, фармації. Завдяки розміру, формі, хімічному складу, заряду та структурі наночастинки мають унікальні властивості, що робить їх перспективними матеріалами для застосування у різноманітних сферах діяльності людини [3]. У медицині наночастинки мають перспективу застосування задля ультрачутливого виявлення біомолекул (біосенсори), діагностичної візуалізації, фотодинамічної терапії, цільової доставки лікарських речовин до органів-мішеней [4, 5].

Зростає інтерес фахівців різних спеціальностей до наночастинок золота. Це пов’язано з перспективністю широкого їх застосування: як векторів для цільової доставки протипухлинних, протизапальних та протимікробних засобів, для створення біосенсорів, а також як контрастних агентів, ефективніших за стандартні препарати на основі йод-похідних сполук [6]. Залишається відкритим питання щодо можливості самостійного використання наночастинок золота як протипухлинних препаратів.

На жаль, відомостей про вплив наночастинок золота на ракову тканину ПЗ людини майже немає. Продемонстровано цитотоксичний вплив наночастинок золота in vitro на клітини лінії РС-3 аденокарциноми ПЗ людини [7]. Що стосується вивчення протипухлинної активності наночастинок золота in vivo відносно раку ПЗ, то попередніми нашими дослідженнями було показано цитотоксичний вплив високої дози нанозолота (160 мкг/кг маси тіла) на нефросубкапсулярні гетеротрансплантати тканини раку ПЗ людини (ксенографти) [8]. Проте залишається відкритим питання про ефективність застосованого нами препарату при використанні значно менших доз.

Мета дослідження. Дослідити на експериментальній моделі гетеротрансплантації тканини раку ПЗ протипухлинну ефективність низьких доз колоїдного розчину наночастинок золота (0,64 мкг/кг, 1,7 мкг/кг та 6,4 мкг/кг) і виявити можливу залежність ефекту від дози діючого агента.

Матеріали та методи дослідження. У до-слідженні використано полідисперсний колоїдний розчин наночастинок золота із середнім розміром 25,2 нм із переважанням частинок розміром 21,8 нм (42,5% від загальної кількості наночастинок). Розмірні характеристики вихідного розчину підтверджено дослідженнями на лазерно-кореляційному спектроскопі та електронною мікроскопією.

Досліди проведено на самцях мишей лінії СВА із масою тіла 20-25 г, отриманих у розплід-нику віварія ДУ «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка НАМН України». Тварини утримувались у стандартних умовах віварія із вільним доступом до питної води та біокорму. Тварин утримували та використовували згідно з біоетичними вимогами Європейської конвенції про захист хребетних тварин, яких використовують в експеримен- тальних та інших наукових цілях (Страсбург, яяя1986 р.).

Тестування протипухлинної активності проводили нефро-субкапсулярним методом, що полягає у трансплантації злоякісної пухлини, в даному випадку тканини аденокарциноми ПЗ людини, під капсулу нирки мишей лінії СВА та реєстрації росту пухлини на тлі введення тестованої речовини [9]. Обов’язковим елементом методики є гістологічна оцінка протипухлинного ефекту [10]. В експериментальних дослідженнях використано злоякісні пухлини, видалені під час планової радикальної простатектомії у шести хворих на рак ПЗ (за попередньою інформованою згодою) в ДУ «Інститут урології НАМН України», які не отримували попередньої фармакотерапії.

Фрагменти пухлини відбирали в стерильних умовах, доставляли в лабораторію в охолодженому середовищі МЕМ (Serva), що містило сольову суміш Хенкса і буфер HEPES. Пухлину нарізали на шматочки масою 1 мг і підсаджували під капсулу лівої нирки мишей (по 2 ксенографти) під хлоралгідратним наркозом. Після триденного періоду вільного росту пухлини мишам вводили підшкірно ізотонічний водний розчин нанозолота в дозах 0,64 мкг/кг, 1,7 мкг/кг або 6,4 мкг/кг маси тіла, а контрольним тваринам - розчинник впродовж подальших трьох днів. Через 24 години після останнього введення препарату тварин декапітували під легким ефірним наркозом, ксенографти і сім’яники видаляли і зважували. Протипухлинний ефект оці-нювали за ступенем гальмування зростання маси ксенографтів, порівнюючи величини приросту їх маси в дослідній і контрольній групах, а також за гістологічними ознаками. З метою перевірки андрогенної залежності пухлини, окрему групу склали миші-реципієнти ксенографтів, які були кастровані перед трансплантацією пухлини і в подальшому отримували підшкірно тільки фізіологічний розчин. Достовірність різниці (Р<0,05) оцінювали за критерієм t Стьюдента.

При патоморфологічному дослідженні післяопераційного матеріалу всі пухлини були ідентифіковані як аденокарциноми. Для гістологічного вивчення вихідної пухлинної тканини ксенографтів і сім’яників готували зрізи товщиною 4-5 мкм, фарбували їх гематоксиліном і еозином. Гістологічні препарати вивчали на світлооптичному мікроскопі Leіka DME (Leica Microsystems, Німеччина).

Результати та їх обговорення. П’ять пухлин при гістологічному дослідженні отримали оцінку 6 балів за індексом Глісона, лише одна пухлина - 7 балів. Залежність від андрогенів підтверджувалась повним гальмуванням приросту маси ксенографтів у групі кастрованих тварин. У всіх досліджуваних групах із введенням наночастинок золота спостерігалось повне гальмування приросту маси у порівнянні з контрольною групою (табл. 1). Найбільший регрес приросту маси ксенографтів спостерігався при застосуванні наночастинок золота в дозі 1,7 мкг/кг. Дозозалежного ефекту при застосувані різних доз нанозолота не спостерігалось. Протипухлинна ефективність препаратів була достатньо високою навіть при низьких досліджених дозах.

У ксенографтах аденокарциноми ПЗ людини, вилучених у тварин контрольної групи на 7-й день після трансплантації, в цілому зберігалась структура первинної пухлини. Спостерігався набряк строми і невелика інфільтрація лейкоцитами на периферії ксенографтів як прояв реакції імунної системи на трансплантат (рис. 1). Така реакція також мала місце у всіх дослідних групах.

При застосуванні препарату нанозолота в дозі 0,67 мкг/кг в епітеліальних клітинах ксенографтів спостерігали помірно виражену вакуолізацію цитоплазми без значних деструктивних змін, проте в них зберігались великі світлі ядра з великим чітким ядерцем (рис. 2). При збільшенні дози до 1,7 мкг/кг значно зростала вакуолізація цитоплазми. Вакуолі були великими, самі клітини виглядали пошкодженими, а їх розташування дезорганізованим. Деякі клітини мали розірвані мембрани внаслідок внутрішньо-клітинного набряку. Їх ядра були меншого розміру, більш гіперхромними в порівнянні з такими у групі тварин, яким вводили нанозолото у дозі 0,67 мкг/кг (рис. 3). При дозі 6,4 мкг/кг ще більша частина епітеліальних клітин аденокарциноми мала гіперхромні ядра. У частині цих клітин ядра були пікнотичні, та спостерігалась значна редукція цитоплазми (рис. 4).

Загалом ці зміни оцінюються нами як прояв початкового руйнування, який в поодиноких клітинах досягав повної деструкції.

Хоча дані вимірювання маси ксенографтів не продемонстрували залежності ефекту від дози препарату, результати гістологічного дослідження свідчать про наявність такої залежності в діапазоні досліджених доз. За даними наших попередніх досліджень [8], застосування нанозолота в дозі 160 мкг/кг призводило до більш виражених патологічних змін, а саме, некрозу у стромі та малігнізованих епітеліальних клітинах, сильного перицелюлярного набряку навколо епіте-ліальних клітин або до руйнування плазмолеми.

Ми припускали, що гальмування росту пухлини може бути спричинене зменшенням продукції тестикулярного тестостерону у мишей-реципієнтів внаслідок патогенного впливу нанозолота на сім’яники, тим більше, що в літературі є відомості про ушкоджуючий ефект наночастинок золота розміром 2-5 нм у сім’яниках мишей [11]. Проте в наших дослідах маса сім’яників у контрольній та дослідних групах не відрізнялась, а при гістологічному дослідженні не виявлено патологічних змін у гонадах, що свідчить про ймовірний прямий вплив препарату на пухлинну тканину.

При розтині тіл мишей-реципієнтів видимих патологічних змін органів і тканин не спостерігали.

Ідея застосування наночастинок золота в медицині, так само як і інших наноматеріалів, базується на тому, що в нанорозмірній формі (до 100 нм) речовини набувають унікальних властивостей, відмінних від властивостей речовин у макродисперсній формі. Зокрема, велика питома поверхня наночастинок призводить до того, що поверхневі явища починають переважати в процесах їх взаємодії з макромолекулами і біологічними об’єктами [12]. Наслідком цього є те, що навіть невисокі концентрації наночастинок, які не мають значного токсичного ефекту, можуть значною мірою впливати на живі організми.

Природним чином виникає питання про ймовірні механізми протипухлинної дії наночас-тинок золота. Особливу увагу привертає висо-ка афінність наночастинок золота до пухлинних клітин в організмі тварин-пухлиноносіїв [13], Вона пояснюється кількома причинами, зокрема, селективним накопиченням наночастинок у пухлинах через порушення проникності клітинних мембран, зміною електрохімічних властивостей наночастинок при контакті з цими клітинами, їх каталітичними властивостями щодо біохімічних процесів на поверхні і всередині клітин [14, 15].

З літератури відомо, що наночастинки золота потрапляють всередину клітини шляхом ендоцитозу [16]. Залежно від розміру, вони мають різну внутрішньоклітинну локалізацію. Наночастинки розміром 10-20 нм переважно накопичуються у вакуолях. Для 30-45 нм характерна акумуляція в лізосомах. Наночастинки розміром 3-5 нм легко потрапляють до ядра. Саме тому біологічні ефекти наночастинок металів суттєво залежать від їх розміру. Спираючись на ці відомості, можна припустити, що в наших експериментах із використанням наночастинок золота розміром близько 20 нм їх накопичення відбувалось здебільшого у вакуолях. Це підтверджується значною вакуолізацією клітин у дослідженому матеріалі.

Оцінюючи перспективи терапевтичного застосування наночастинок золота, слід брати до уваги їхню можливу загальну токсичність щодо органів і систем. Доцільно відзначити, що в наших дослідах під час застосування препарату нанозолота у тварин-реципієнтів не відмічалося порушень у поведінці. Вони активно споживали їжу та воду, мали звичайну рухову активність і нормальний вигляд шерсті. Але зважаючи на короткий термін введення наночастинок золота, остаточні висновки можливо зробити лише на підставі більш тривалих досліджень.

Висновки

1. Колоїдний розчин наночастинок золота із середнім розміром 25,2 нм при парентеральному введенні в діапазоні доз 0,64-6,4 мкг/кг маси тіла призводить до зупинки росту ксено-графтів андрогензалежної аденокарциноми ПЗ людини у мишей.

2. Результати гістологічного дослідження ксенографтів свідчать про наявність ознак дозозалежного цитотоксичного впливу наночастинок золота на малігнізований епітелій ПЗ.