Г.В. Дубровська, К.В. Онищенко, Л.В. Перета, В.М. Григоренко, І.Я. Скрипкіна

Діагностичне та прогностичне значення гена rassf1 у хворих на нирково-клітинний рак

Вступ. Нирково-клітинний рак (НКР) - найбільш поширена злоякісна пухлина нирки, що включає в себе низку підтипів новоутворень нирки з різноманітними патогістологічними, генетичними та епігенетичними характеристиками. У 2016 р. в Україні було зареєстровано 4486 випадків захворювання на рак нирки, згідно з даними Національного Канцер Реєстру. За період 2016 року від цього типу раку померло 2030 осіб.

НКР є другою за поширеністю причиною смерті у всьому світі і становив 8,8 мільйона смертей у 2015 році. За даними Всесвітньої органі-зації охорони здоров’я очікується, що протягом наступних двох десятиліть число нових випадків захворювання виросте приблизно на 70%.

Клінічні дослідження вказують, що НКР є майже нечутливим до променевої та хіміотерапії, тому основним методом лікування таких хворих є хірургічне видалення пухлини. Лише у 20% пацієнтів спостерігається слабка відповідь на хіміотерапію і лише 5% пацієнтів отримують повний ефект [1].

Також показано, що на момент виявлення захворювання у 25-30% пацієнтів діагностуються метастази і навіть після радикального оперативного лікування [2] 20-30% хворих не переживає 2-річного терміну. Однак, якщо захво-рювання виявлене на ранніх стадіях і не метастазує (поширюється на інші органи) або проникає глибше в тканини нирки, то 5-річна виживаність становить 65-90% [3]. Незважаючи на порівняно невелику частку в загальній структурі онкологічних захворювань, ці види раку є причиною смертності або інвалідності досить великої кількості пацієнтів через пізню діагнос-тику, а також високу частоту виникнення рецидивів і прогресії.

Виявлення хворих на НКР є малоефективними у зв’язку з переважно безсимптомним перебігом ранніх стадій цього захворювання. На жаль, в Україні нині рання діагностика цього типу раку у пацієнтів без симптомів патології складає лише 16%. У той же час, цей тип раку виліковний в більш ніж 90% випадків, якщо діагноз поставлений на ранній стадії. Тому вкрай важливо розробити методи ранньої діагностики НКР, а також, як ніколи гостро, постає питання точного визначення типу пухлини і її молекулярно-генетичних особливостей, через те, що таргетна терапія в більшості випадків є високо специфічною та більш ефективною.

Рак завжди пов’язаний з різноманітними молекулярно-генетичними змінами і порушеннями, що стають причиною утворення та подальшого розвитку пухлин. Завдяки детекції цих змін стає можливим прогнозувати перебіг за-хворювання [4].

Розвиток НКР пов’язаний з низкою змін у багатьох генах-супресорах, які можуть інактивуватися в результаті мутацій, протяжних алельних делецій [5], метилування СрG-острівців у промторних ділянках [6]. У нормальних соматичних клітинах більшість CpG-острівців не метильовані. Абеpрантне метилування CpG-острівця будь-якого гена-супресору пухлинного росту може призвести до припинення його експресії, сприяючи ініціації та прогресії пухлини.

Відомо, що мікросателітні перебудови можуть виступати як потенційні мішені діагностики раку [7]. Для розвитку РН найбільш типовими генетичними аномаліми є делеції, які відбуваються на короткому плечі хромосоми 3 (LОН 3p) [8]. Вона складає близько 75,8% всіх випадків. Ця аномалія збігається з проявом хвороби фон Хиппеля-Ліндау з частотою 34-56% випадків при розвитку одиничної карциноми [9].

Суперсімейство RAS-малигх ГТФ-зв’язую-чих білків відіграє вирішальну роль у внутрішньо-клітинних шляхах сигналізації, а головним чином, в активації МАРК каскаду [10].

Ген RASSF1 (Ras association domain family1) розташований на довгому плечі хромосоми 3 (локус 3р21.3) та має вісім екзонів (1a, 1b, 2ab, 2g, 3, 4, 5, та 6). RASSF1 - досить добре вивчений онкосупресор, який може впливати на клітинний цикл, динаміку тубуліну, апоптоз та стабілізацію мікро-трубочок [11]. Існують сім різних ізоформ RASSF1, які утворюються внаслідок диференціального використання двох промоторів та альтернативного сплайсингу. На сьогодні встановлена біологічна роль лише двох білкових ізоформ - RASSF1А та RASSF1С, що є основними ізоформами RASSF1. Ізоформа А транскрибується від верхнього промотору, а ізоформа С - від нижнього. Обидві промоторні ділянки містять незалежні CpG-острівці. Метилування кожного з них вимикає транскрипцію RASSF1. Також було виявлено, що гіперметилування першого промотора асоційовано із виникненням різних типів пухлин [12].

У цьому дослідженні було проаналізовано ступінь метилування CpG-острівця А-ізоформи гена, а також мікросателітні перебудови гена RASSF1 з використанням високополіморфних маркерів D3S966 та D3S1568.

Дана робота присвячена оптимізації наявних та створенню нових методичних підходів з аналізу статусу метилування вибраних генів-маркерів та визначенню мікросателітних перебудов для впровадження в діагностичну практику з метою раннього виявлення порушень в організмі людини, пов’язаних з розвитком онкологічних хвороб, зокрема, РН.

Матеріали та методи дослідження. Групу обстеження склали 50 хворих із верифікованим діагнозом рак нирки, у яких зі зразків пухлин та умовно здорових тканин була виділена геномна ДНК (табл. 1). Розчин та реактиви для виділення геномної ДНК: «Gene Elute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit» («Sigma», США).

Визначення алельного дисбалансу в локусі гена RASSF1 виконували з використанням високополіморфних маркерів D3S966 та D3S1568 для РН в парних зразках пухлинної і умовно нормальної тканини методом ПЛР. Реакційна суміш для проведення ПЛР загальним об’ємом 20 мкл складалась з 300 нг геномної ДНК, 1Х DreamTaq Green Bufer («Thermo Scientific», США), 200 мкМ dNTP, 1,5 од. DreamTaq DNA polymerase («Thermo Scientific», США) і 200 мкМ кожного з праймерів. Ампліфікацію здійснювали з наступних умов: денатурація - +96 °С, 1 хв. (в першому циклі - 4 хв.); реаосоціація праймерів протягом 1 хв. за відповідних температур (табл. 2), синтез - + 72 °С; 40 циклів. Прилад для проведення ампліфікації «Applied Biosystems 2720® thermal cycler» («Applied Biosystems», США). Детекцію продуктів ПЛР проводили за допомогою методу вертикального гель-електрофорезу в 8% ПААГ у 1хТВЕ буфері (0,02 М ЕДТА, 1 М тріс, 1 М борна кислота, рН 8,3). Для приготування ПААГ брали 6,665 мл 30% акриаміду, 2,5 мл 10хТВЕ, 200 мкл 10хПСА (персульфат амонію) та 15,650 мл деіонізованої води. Візуалізацію розділених продуктів ПЛР після фарбування бромистим етидієм проводили за допомогою ChemiDoc™ XRS+ System (Bio-Rad, США).

Епігенетичну мінливість транскрипту RASSF1A визначали за допомогою метил-специфічної ПЛР, для чого попередньо проводили бісульфітну обробку ДНК з використанням набору EZ DNA Methylation-Gold Kit (Zymo Research, США).

Реакцію проводили використовую- чи наступні послідовності праймерів: F 5’-GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3’ та R 5’-AACCCCGCGAACTAAAAACGA -3’ (169 п.н.) у приладі для проведення ампліфікації «Applied Biosystems 2720® thermal cycler» («Applied Biosystems», США) з використанням набору реагентів «DreamTaq™ Green Polymerase» («Thermo Scientific», США). Реакцію проводили в 20 мкл суміші згідно з протоколом до використаного реагенту.

Ампліфікацію здійснювали за наступними умовами: перший цикл денатурації за температури 95 °С протягом 5 хв., денатурація за температури 95 °С протягом 30 с, температура реасоціації праймерів - 58 °С 20 с, синтез - 72 °С 20 с. Всього 40 циклів. У якості позитивного контролю використовували штучно метильовану ДНК, отриману за допомогою набору реактивів «CpG Methyltransferase (M. SssI)» («Thermo Scientific», США). Для ідентифікації очікуваних фрагментів проводили ПЛР-продуктів у 1,5%-вому агарозному гелі та візуалізували шляхом фарбування бромистим етидієм з подальшою документацією результатів за допомогою ChemiDoc™ XRS+ System (Bio-Rad, США).

Статистичну обробку даних проводили з використанням пакета прикладних програм STATISTICA 7.0 (StatSoft. Inc., США). Статистичну значимість відмінностей між досліджуваними групами аналізували за допомогою точного критерію Фішера та U-критерію. Відмінності вважалися статистично значущими при p<0,05.

Результати та їх обговорення. Детекцію мікросателітних змін проводили за шляхом ви-значення змін двох високополіморфних маркерів, що локалізовані на хромосомі 3 людини (локуси 3р21.3 та 3р25.3) за допомогою ПЛР-аналізу на гДНК з біопсій пухлин пацієнтів з РН та навколишньої умовно здорової тканини, взятої не менше 1,5 см від місця ураження. Мікросателітний аналіз був проведений для 50 пацієнтів і включав два мікросателітні маркери гена RASSF1 (D39S966 та D3S1568). Інформативність маркера D39S966 склала 94% (47 з 50), а маркера D3S1568 - 80% (44 з 50).

У пухлинах РН сумарна втрата гетерозиготності (LOH) за двома маркерами локуса гена RASSF1 склала 35,4%: за маркером D39S96 - 14,9% пацієнтів (7 з 47), за маркером D3S1568 - 20,5% (9 з 44) пацієнтів, відповідно.

Отримані нами дані щодо епігенетичних порушень транскрипту А гена RASSF1 склали 72% (36 з 50) метилування гДНК з пухлин та 42% (21 з 50) метилування гДНК з прилеглих (умовноздорових тканин) у пацієнтів з РН. Для цього гена було обраховано чутливість та специфічність і вони склали 68% та 30%, відповідно. Висунуто припущення, що одночасне виявлення на ДНК здорової паренхіми нирки метилування RASSF1А та алельного дисбалансу за маркерами D39S966 та D3S1568 може бути ознакою несприятливого прогнозу для даного пацієнта з раком нирки, що потребуватиме додаткового післяопераційного лікування.

Висновки

Отже, в результаті проведених досліджень з виявлення структурних та епігенетичних змін гена RASSF1 (втрата гетерозиготності та метилування промотора) у пухлинах РН отримані дані, які свідчать про те, що висока частота інак-тивації RASSF1 як за допомогою LOH (35,4%), так і за допомогою метилування (72%), що спостерігається при даному типі онкологічного за-хворювання може бути використана у подальшому для створення тест-системи ранньої неінвазивної діагностики карциноми нирки на позаклітинних ДНК плазми крові.

Робота виконана при грантовій підтримці Національної академії наук України за конкурс-ним проектом Цільової комплексної міждис-циплінарної програми наукових досліджень «Фундаментальні основи молекулярних та клітинних біотехнологій» (проект 0115U002951).